袁俐，袁夢(mèng)嵐，陳旭紅，姜忠敏，李艷霞，馬曉芳，劉曉智

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道常見(jiàn)三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病與雌激素的長(zhǎng)期持續(xù)刺激有關(guān)，其中雌激素受體 α（estrogen receptor alpha，ERα）參與該病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，但其具體調(diào)控機(jī)制尚不明確[1]。小類(lèi)泛素化修飾蛋白（small ubiquitin-like modifier，SUMO）是近年發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)結(jié)構(gòu)及生成和降解循環(huán)通路均與泛素化蛋白相似，但功能迥異的蛋白質(zhì)翻譯后修飾蛋白，其通過(guò)異肽鍵與靶蛋白共價(jià)結(jié)合，調(diào)控靶蛋白的生物學(xué)功能[2]。新近研究發(fā)現(xiàn)，ERα是SUMO-1的確切靶蛋白[3]，但兩者如何在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮作用尚不知曉。本文通過(guò)檢測(cè)ERα和SUMO-1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)，分析其與患者年齡、組織學(xué)病理類(lèi)型及病理分級(jí)的關(guān)系，探討兩者在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中可能存在的相互協(xié)調(diào)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2006年1月—2013年12月天津市第五中心醫(yī)院（我院）病理科初診為子宮內(nèi)膜癌的腫瘤組織蠟塊共50例，所有患者術(shù)前均未經(jīng)放療、化療或激素治療。另選取35例大致正常及增生的子宮內(nèi)膜組織作為對(duì)照。所有病例HE染色切片均經(jīng)病理醫(yī)生復(fù)查，并就組織類(lèi)型、壞死、核分裂相等進(jìn)行特征評(píng)估。

1.2 主要試劑 鼠抗人SUMO-1單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），兔抗人ERα多克隆抗體及相應(yīng)二抗（北京中杉生物技術(shù)有限公司）；Envision試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒（美國(guó)Dako公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色 取上述存檔的石蠟組織塊，連續(xù)組織切片，厚5 μm，常規(guī)HE染色及免疫組織化學(xué)染色。采用Envison兩步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）中行高壓熱修復(fù)，山羊血清37℃封閉30 min；甩去血清，滴加適當(dāng)稀釋度的抗體工作液（SUMO-1為 1∶1000，ERα 為 1∶200），4℃過(guò)夜，順序加入生物素化二抗和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，顯色后蘇木素復(fù)染，封片。用已知陽(yáng)性片和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

1.3.2 結(jié)果測(cè)定標(biāo)準(zhǔn) 以胞質(zhì)和（或）胞核內(nèi)明顯的黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色。2名病理醫(yī)師獨(dú)立觀察，選染色均勻腫瘤區(qū)10個(gè)高倍視野，以陽(yáng)性細(xì)胞百分率為判定標(biāo)準(zhǔn)。陽(yáng)性強(qiáng)度判斷采用兩種計(jì)分結(jié)合的方法：①選染色均勻腫瘤區(qū)10個(gè)高倍視野，以陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比計(jì)分（0～3分）：切片中無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞記0分；陽(yáng)性細(xì)胞率＜25%記1分；陽(yáng)性細(xì)胞率26%～50%記2分；陽(yáng)性細(xì)胞率≥51%記3分。②按染色強(qiáng)度計(jì)分（0～3分）：不著色0分；黃色1分；棕黃色2分；黃褐色3分。①和②兩項(xiàng)評(píng)分相加，0～1分為陰性（-），2分為弱陽(yáng)性（+），3～4分為陽(yáng)性（++），5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.3.3 免疫熒光雙染步驟 該部分實(shí)驗(yàn)步驟基本同1.3.1，與1.3.1步驟不同的是以SUMO-1和ERα一抗同時(shí)加入代替之前的分別加入，二抗為相應(yīng)的四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamine，TRITC）和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的熒光抗體，抗體稀釋度均為1∶500，以 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染，倒置熒光顯微鏡下觀察，奧林巴斯DP72成像系統(tǒng)采集圖像，觀察細(xì)胞共染情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。定性資料用率表示，差異性檢驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)，一致性分析采用Kappa檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌臨床資料 本研究共選取50例確診病例。患者34～69歲，平均（55.7±11.9）歲。絕經(jīng)前患者17例，絕經(jīng)后患者33例，絕經(jīng)年限平均（8.5±3.2）年，最長(zhǎng)24年。病理類(lèi)型：子宮內(nèi)膜樣腺癌39例，混合性癌8例，透明細(xì)胞癌3例。組織學(xué)分級(jí)：高分化（G1）17例，中分化（G2）22例，低分化（G3）11例。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.2.1 2組患者SUMO-1蛋白和ERα蛋白在子宮內(nèi)膜中的表達(dá) SUMO-1蛋白和ERα蛋白在正常子宮內(nèi)膜和不同病理分級(jí)子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)見(jiàn)圖1（見(jiàn)后插三）。SUMO-1蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組，而ERα蛋白則相反，2組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表12 組患者SUMO-1蛋白和ER-α蛋白在子宮內(nèi)膜中陽(yáng)性表達(dá)率比較 例（%）

2.2.2 子宮內(nèi)膜癌患者SUMO-1蛋白和ERα蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 SUMO-1蛋白在≥55歲的子宮內(nèi)膜癌患者中的表達(dá)明顯高于＜55歲者，而ERα蛋白則相反，2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同樣SUMO-1蛋白在絕經(jīng)后的子宮內(nèi)膜癌患者中的表達(dá)明顯高于未絕經(jīng)者，而ERα蛋白則相反，2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SUMO-1蛋白的表達(dá)隨著子宮內(nèi)膜癌組織學(xué)分級(jí)的下降而下降，而ERα蛋白則相反，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2種蛋白在不同病理類(lèi)型的患者間的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 子宮內(nèi)膜癌患者SUMO-1蛋白和ER-α蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

2.3 免疫熒光雙染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 SUMO-1蛋白和ERα蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的共表達(dá)關(guān)系 42例SUMO-1陽(yáng)性的子宮內(nèi)膜癌組織中ERα蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為88.10%（37/42），8例SUMO-1陰性的子宮內(nèi)膜癌組織中ERα蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為0.00%（0/8）；37例ERα陽(yáng)性的子宮內(nèi)膜癌組織中SUMO-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為100.00%（37/37），13例ERα陰性的子宮內(nèi)膜癌組織中 SUMO-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為 38.46%（5/13）。SUMO-1和ERα蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中共表達(dá)的陽(yáng)性率為74.00%（37/50）。對(duì)兩者按照雙向有序且屬性相同的特征進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，表明兩者一致性較好（Kappa=0.875，Z=5.473，P=0.001），見(jiàn)表 3。

表3 SUMO-1和ERα蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的共表達(dá)關(guān)系

2.3.2 SUMO-1蛋白和ERα蛋白在中分化子宮內(nèi)膜癌組織中的共表達(dá)定位 在子宮內(nèi)膜癌組織中SUMO-1蛋白主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，而ER-α蛋白則主要定位于細(xì)胞核，見(jiàn)圖2（見(jiàn)后插三）。

3 討論

一般認(rèn)為，子宮內(nèi)膜癌根據(jù)其發(fā)病機(jī)制和生物學(xué)行為特點(diǎn)可分為雌激素依賴型（Ⅰ型）和非雌激素依賴型（Ⅱ型）[4]。雌激素依賴型子宮內(nèi)膜癌絕大部分為子宮內(nèi)膜樣癌，少部分為黏液腺癌；非雌激素依賴型子宮內(nèi)膜癌包括漿液性癌和透明細(xì)胞癌等[5]。

在雌激素依賴性子宮內(nèi)膜癌中，ERα和ERβ均參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展，但是由于ERβ表達(dá)于多種組織器官，其功能覆蓋范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了經(jīng)典雌激素受體機(jī)制范疇[6]。本研究選擇與子宮內(nèi)膜癌關(guān)系密切的ERα為研究對(duì)象，研究其與蛋白質(zhì)翻譯后的修飾因子SUMO的關(guān)系。Hilmi等[3]從分子生物學(xué)研究角度報(bào)道ERα為SUMO-1作用的靶基因，共同參與調(diào)節(jié)選擇性雌激素受體下調(diào)因子（selective estrogen receptor downregulator，SERD） 的表達(dá)和功能。其研究結(jié)果表明ERα蛋白被SUMO-1共價(jià)結(jié)合以后能夠在雌激素水平持續(xù)降低的情況下明顯抵抗雌激素活性。

雖然ERα與SUMO-1的關(guān)系密切，但至今未見(jiàn)兩者在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)及功能特點(diǎn)的相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌患者SUMO-1蛋白和ERα蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在不同年齡、不同絕經(jīng)狀態(tài)、不同組織學(xué)分級(jí)的患者中不同，推測(cè)可能與低分化子宮內(nèi)膜腫瘤細(xì)胞喪失雌激素生成和分泌功能有關(guān)。與此相對(duì)比，SUMO-1在正常子宮內(nèi)膜中表達(dá)水平極低（14.29%），但在子宮內(nèi)膜癌中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高（84.00%）。通過(guò)對(duì)子宮內(nèi)膜癌中SUMO-1和ERα的表達(dá)按照雙向有序且屬性相同的特征進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩者一致性較好。

本研究發(fā)現(xiàn)所有ERα表達(dá)陽(yáng)性的子宮內(nèi)膜癌均出現(xiàn)SUMO-1的陽(yáng)性表達(dá)，但并非所有SUMO-1表達(dá)陽(yáng)性的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞均伴隨ERα表達(dá)陽(yáng)性。因此認(rèn)為SUMO-1可能在ERα介導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了一定的調(diào)節(jié)功能，或者說(shuō)ERα蛋白發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)節(jié)功能均伴隨著SUMO-1的參與調(diào)節(jié)，但SUMO-1的功能亦不僅只限于對(duì)ERα蛋白的調(diào)控，同時(shí)可能調(diào)控其他多組蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)SUMO-1和ERα在子宮內(nèi)膜癌中存在共表達(dá)關(guān)系，兩者在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮了協(xié)同作用，其具體機(jī)制研究將成為我們下一步工作的重點(diǎn)。

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