田振軍,賈單單,蔡夢昕,Du Shaojun

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間歇運動對心梗大鼠心肌LIF及其受體表征和細胞凋亡的影響

田振軍1,賈單單1,蔡夢昕1,Du Shaojun2

目的：探討間歇運動對心肌梗死(myocardial infarction,MI)大鼠心肌細胞凋亡和心肌白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)及其受體LIFR表征的影響。方法：3月齡SD雄性大鼠，隨機分為假手術組(Sham)、心梗安靜組(MI)、心梗+間歇運動組(ME)，每組12只。左冠狀動脈前降支(Left anterior descending coronary artery，LAD)結扎建立MI模型，ME組采用小動物跑臺進行8周間歇訓練。訓練結束后次日腹腔麻醉，血流動力學方法評定心功能，Masson染色觀察分析心肌膠原容積(Collagen volume fraction,CVF)百分比，TUNEL法檢測細胞凋亡，Western Blot檢測心肌Bcl-2、Bax、LIF、LIFR、p-STAT3和STAT3蛋白表達，RT-qPCR檢測心肌lif和lifrmRNA表達。結果：心梗大鼠心功能顯著降低，心肌纖維化水平和細胞凋亡顯著增加。間歇運動可有效改善心梗大鼠心功能，降低心肌纖維化水平，升高Bcl-2/Bax比值，減少TUNEL陽性顆粒，上調心肌LIF及LIFR蛋白與基因的表達和STAT3磷酸化水平。結論：間歇運動可顯著促進心梗大鼠心肌LIF蛋白表達，激活LIF/LIFR/STAT3通路，抑制心肌細胞凋亡，改善心梗心臟病理重塑和心功能。開展運動干預缺血心臟LIF表征研究與心臟的保護效應，將為心?；颊哌\動康復手段篩選提供新思路。

間歇運動；心肌梗死；細胞凋亡；白血病抑制因子；鼠；動物實驗

心梗(myocardial infarction,MI)導致心肌缺血缺氧、炎癥反應、氧化應激、心肌細胞壞死和凋亡顯著增加，心肌膠原異常增生，發(fā)生替代性纖維化，心功能紊亂[10,14,25]。臨床研究表明，運動可作為治療和預防心梗的重要手段[4,12,29]，適宜的運動訓練可降低心?；颊咚劳雎省桶l(fā)率、心肌炎癥反應[28]和細胞凋亡水平[1]，減輕心肌纖維化[37]，改善組織重塑和心功能紊亂[26]。運動可改善老齡心臟的心功能，減少心臟病風險，改善線粒體功能紊亂誘導的細胞凋亡[22]。有氧能力與心臟病的發(fā)病率和死亡率呈負相關，間歇運動可作為心梗患者的主要運動方式[8]。

白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)屬于IL-6家族的多效分子，在細胞增殖與凋亡[36]、胚胎分化與發(fā)育[13]、神經免疫應答[17]、多功能干細胞誘導[34]、血管形成和能量代謝[39]等方面發(fā)揮重要作用。LIF預處理可改善心肌缺氧/復氧導致的細胞凋亡與損傷[33]，抑制心梗大鼠心肌細胞凋亡，促進心肌再生[42]。Berry等報道，心梗大鼠心肌缺血部位外源性注射LIF可降低心肌細胞凋亡指數，保護心臟組織結構和功能[5]。LIF與其受體LIFR-gp130結合可激活JAK2-STAT3通路，在消耗心衰患者心肌谷胱甘肽、減少活性氧產生和抑制心肌細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用[21]，LIF是近年來高度關注的心肌保護因子，也是收縮誘導的肌肉因子。運動訓練可促進骨骼肌分泌LIF[16]，但運動改善心梗大鼠心功能是否與LIF有關，鮮見文獻報道。因此，本研究擬探討間歇運動對心梗大鼠心肌LIF及其受體表征和細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要試劑：Tween20、BCA蛋白定量試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德)、TAKARA-RNA定量反轉錄試劑盒、兔抗多克隆抗體LIF(美國Abcam)、LIFR(美國GeneTex)、p-STAT3/Tyr705(Cell Signaling Technology)、Bcl-2(Bioworld)、小鼠多克隆抗體STAT3(Cell Signaling Technology)、Bax(Bioworld)、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天)、PCR引物(上海生工)等。

主要儀器：PowerLab 8/30生理信號采集系統(tǒng)、BM-II型病理組織包埋機、YT-6C生物組織攤烤片機、LEICA-RM2126切片機、Bio-Rad電泳儀和轉移槽、凝膠成像系統(tǒng)、BX51奧林巴斯光學顯微鏡、尼康熒光顯微鏡、RT-qPCR儀等。

1.2 動物分組與MI模型制備

動物分組：清潔級3月齡雄性Sprague-Dawley大鼠40只(購于西安交通大學實驗動物管理中心，動物質量合格證號：陜醫(yī)動證字08-004)，體重180～220 g，分籠飼養(yǎng)，每籠6只，嚙齒類動物干飼料喂養(yǎng)，自由飲食。動物室溫為20～29℃，相對濕度為40%～50%。適應喂養(yǎng)1周后，進行左冠狀動脈前降支(LAD)結扎手術，術后存活36只，隨機分為假手術組(Sham)、心梗安靜組(MI)、心梗+間歇運動組(ME)，每組12只。

MI模型制備：5%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，采用大鼠呼吸面罩進行呼吸機輔助呼吸(60次/min，潮氣量16 ml，呼吸比2∶1)，連接心電圖。開胸，在左心耳和肺動脈圓錐交界下緣1～2 mm處進針結扎，以心電圖ST段抬高或T波倒置、心肌顏色變淺或變白作為建模成功的標準，逐層縫合關胸。

1.3 運動方案

1.4 心功能指標測定

采用PowerLab 8/30生理信號采集系統(tǒng)檢測大鼠心臟血流動力學指標，評定大鼠心功能。8周運動結束后，常規(guī)稱體重、腹腔麻醉、測定心電圖。右頸總動脈逆行插管至左心室，測試左室收縮壓(Left ventricular systolic pressure,LVSP)、左室舒張末壓(Left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)、左室壓力最大上升速率(+dp/dtmax)和最大下降速壓(-dp/dtmax)。

1.5 心臟樣本處理與MASSON染色

待心功能指標測畢后，迅速摘取心臟，除血稱重。將心臟組織分為兩部分，一部分組織置于液氮固定24 h后，轉至-80℃低溫冰箱保存。另一部分組織學樣本置于10%中性甲醛液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、制片(5 μm)，Masson染色，光學顯微鏡觀察、拍攝，Image-Pro Plus分析心肌膠原容積百分數(CVF%)。

1.6 免疫熒光組化實驗和TUNEL染色

切片脫蠟至水，PBS清洗，微波抗原修復，PBS清洗，正常山羊血清封閉(37℃,40 min)，孵育一抗(LIF，1∶50,LIFR，1∶200,4℃過夜)，PBS清洗，孵育二抗(37℃,30 min)，PBS清洗，甘油加PBS封閉液封片，鏡檢。每組均設置空白對照(PBS代替一抗和二抗)和陰性對照(PBS代替一抗)。TUNEL檢測用切片經脫蠟至水，滴加20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K(37℃，30 min)，PBS清洗(5 min/次×5次)，嚴格按照試劑說明書配置TUNEL檢測液，充分混勻，滴加于待測樣品上(37℃,60 min)，PBS清洗(5 min/次×3次)，抗熒光淬滅封片液封片。尼康熒光顯微鏡觀察攝片。

1.7 Western Blot和RT-qPCR實驗

用于Western Blot實驗的心肌組織，常規(guī)研磨、蛋白抽提、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，300 mA恒流轉膜，3%BSA封閉，孵育一抗LIF/LIFR(1∶500/1∶200,4℃過夜)、STAT3/p-STAT3(1∶2 000/1∶1 000)、Bcl-2/Bax(1∶500/1∶100)。TBST清洗(5 min/次×5次)，孵育二抗(40 min,室溫)，TBST清洗，ECL液發(fā)光成像。內參為GAPDH(1∶10 000)。

RNA提取，用Trizol試劑提取心肌總RNA，嚴格按照TAKARA-RNA定量和反轉錄試劑盒說明書操作，將RNA反轉錄為cDNA，利用已選取的引物，進行RT-qPCR實驗，內參為GAPDH。引物序列為：lif，F 5′ TCAACTGGCTCAACTCAACG 3′，R 5′ ACCATCCGATACAGCTCGAC 3′，退火溫度60℃；lifr，F 5′ TACAACGAAGGTGCTTTCAGG 3′，R 5′ GCAAGTTCTTCAAACCTGTGG 3′，退火溫度58℃[20]；gapdh，F 5′ CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT 3′，R 5′ AGGGGCCATCCACAGTCTTC 3′，退火溫度55℃。

1.8 數據采集與統(tǒng)計學處理

2 實驗結果

2.1 心功能測定結果

與Sham組比較，MI組LVSP和±dp/dtmax顯著降低(P<0.01)，LVEDP顯著升高(P<0.01)；與MI組比較，ME組LVSP和±dp/dtmax顯著升高(P<0.01，P<0.05)，LVEDP顯著降低(P<0.05，圖1)。表明，心梗嚴重損傷心功能，間歇運動干預可有效改善心功能。

圖1 本研究心臟血流動力學指標變化統(tǒng)計圖

圖2 本研究心肌Masson染色結果光鏡觀察圖(×40和×200)

2.2 心肌間質膠原的Masson染色結果

光鏡下，心肌細胞胞質呈粉紅色、細胞核呈藍褐色、心肌間質膠原呈藍色。心臟梗死邊緣區(qū)心肌組織被瘢痕組織取代，瘢痕區(qū)膠原纖維過度增生，呈條索狀，呈放射狀分布，梗死邊緣區(qū)和非梗死區(qū)膠原纖維向周圍間質延伸。與Sham組比較，MI組心肌膠原CVF%顯著增加(P<0.01)；與MI組比較，ME組心肌CVF%顯著降低(P<0.01，圖2)。表明間歇運動干預可抑制心梗區(qū)膠原纖維過度增生，改善心肌組織病理性重塑。

2.3 心肌TUNEL檢測及細胞凋亡相關蛋白表達結果

TUNEL檢測結果顯示，TUNEL陽性顆粒分布于細胞核部位。與Sham組比較，MI組TUNEL陽性顆粒顯著增加(P<0.01)；與MI比較，ME組TUNEL陽性顆粒顯著減少(P<0.01)。Western Blot結果顯示，與Sham組比較，MI組Bcl-2表達顯著減少(P<0.01)，Bax表達顯著增加(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.01)；與MI組比較，ME組Bcl-2表達顯著增加(P<0.01)，Bax表達顯著降低(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.01，圖3)。

圖3 本研究心肌TUNEL、Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax表達分析熒光顯微觀察和統(tǒng)計圖(×100)

2.4 心肌lif及其受體基因表達結果

RT-qPCR結果顯示，與Sham組比較，MI組心肌lif和lifrmRNA表達顯著增加(P<0.01,P<0.05)；與MI組比較，ME組心肌lif和lifrmRNA表達顯著增加(P<0.01，圖4)。表明心梗大鼠心肌組織lif及其受體基因應激性升高，間歇運動干預可顯著促進心肌組織lif及其受體基因表達。

圖4 本研究梗死邊緣區(qū)lif和lifr mRNA表達統(tǒng)計圖

2.5 心梗邊緣區(qū)LIF及其下游通路蛋白表達結果

Western Blot結果顯示：與Sham組比較，MI組LIF/LIFR(P<0.05，P<0.01)蛋白表達和STAT3(P<0.01)磷酸化水平顯著升高；與MI組比較，ME組 LIF/LIFR(P<0.01,P<0.05)表達和STAT3磷酸化水平顯著升高(P<0.01，圖5)。表明，大鼠心梗邊緣區(qū)LIF及其下游通路被應激性激活；間歇運動顯著促進LIF表達，進一步激活其下游通路。推測，間歇運動干預改善心功能可能與LIF高表達及LIFR-STAT3通路激活有關。

3 討論與分析

3.1 大鼠間歇運動可產生心肌再重構并改善心功能效應

圖5 本研究心梗邊緣區(qū)LIF/LIFR/STAT3通路蛋白表達統(tǒng)計圖

3.2 間歇運動可激活心梗大鼠心臟LIF/LIFR/STAT3通路，抑制心肌細胞凋亡

研究表明，心梗后心臟發(fā)生缺血缺氧、炎癥和氧化應激反應，線粒體功能紊亂，梗死邊緣區(qū)心肌細胞發(fā)生不同程度凋亡，心室發(fā)生病理性重構，心功能嚴重受損[14,15]。運動特別是長期運動可有效減輕心梗心肌細胞凋亡[1]和心肌纖維化現象，促進心臟生理性肥大[27]以及老年大鼠HSP70和線粒體SOD水平增加，顯著減少心肌細胞凋亡[30]。本研究結果顯示，心梗大鼠心肌細胞凋亡顯著增加，間歇運動干預降低了心梗心肌細胞凋亡。文獻表明，心臟存在LIF靶基因，其受體LIFR廣泛分布于心肌細胞膜上，參與心肌肥大、凋亡和血管新生[42,43]。正常情況下心肌lif基因處于沉默狀態(tài)，心肌一旦受損，lif基因便被激活，心肌內源性LIF因子表達增加[39]。正常機體血清LIF表達量很少，一旦機體受到外界刺激如心梗，LIF靶器官大量分泌LIF因子[23]，循環(huán)LIF濃度在一定時間段呈遞增趨勢[42]。LIF預處理心肌細胞，可調節(jié)其收縮功能，改變能量代謝[9]。病理情況下心臟中可檢測到LIF表達和分泌，LIF預處理可減小心梗面積，抑制心臟病理性重構并改善心功能[40]，改善心肌缺氧/復氧誘導的細胞凋亡和損傷[33]。LIF有助于動員骨髓源管家基因向心肌遷移，促進心肌自身干細胞分化為內皮細胞[19]。研究報道，LIF是IL-6家族成員，在抑制心肌細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[18]。遠隔器官注射外源性LIF可減小梗死面積，降低心肌纖維化，抑制細胞凋亡，促進細胞增殖和血管新生[42]。外源性LIF注射于靶器官心肌層缺血交界區(qū)，6周后發(fā)現心功能得到改善，細胞凋亡指數降低[5]，推測LIF可能與抑制心梗心肌細胞凋亡和改善心功能關系密切。因此認為，LIF高表達有助于保護心臟。刺激內源性LIF分泌的手段與方法值得高度關注。運動是刺激機體內源性物質表達分泌的極其重要手段之一。目前發(fā)現，運動可誘導LIF分泌[6,16]。LIF可由骨骼肌和心肌等重要組織器官分泌。運動能否有效刺激靶器官或(和)遠隔器官的內分泌功能產生心臟保護研究值得探討。本研究結果顯示，間歇運動顯著促進心肌LIF及其受體蛋白和基因的表達。

近年發(fā)現，JAKs-STAT3通路受細胞因子刺激參與細胞增殖、分化、凋亡以及免疫調節(jié)等生物學過程，該信號通路與心力衰竭、心肌缺血引起的心功能障礙以及缺血預處理誘導的心肌保護密切相關[41]。STAT3是LIF的下游通路蛋白，LIF與其受體LIFR-gp130結合后，刺激JAKs和STAT3酪氨酸殘基磷酸化，活化的STATs從細胞膜轉位至細胞核，調節(jié)下游通路靶基因的表達，即LIF/LIFR-gp130/JAKs-STAT3通路被激活[24]，該通路的激活可誘導心肌凋亡蛋白和血管新生相關因子表達，如Bcl-2、Bcl-xl，抑制心肌細胞凋亡[43]。LIF與其他IL-6家族因子擁有共同信號受體gp130，LIF結合LIFR與gp130形成異構二聚體后，激活下游通道JAKs-STAT3，保護受損心臟[18]。本研究實驗發(fā)現，心梗大鼠心肌LIF及其受體蛋白、基因表達應激性升高，STAT3磷酸化水平增加，心肌細胞凋亡顯著，心功能減弱；間歇有氧運動顯著提高心梗大鼠心肌LIF及其受體蛋白與基因的表達水平和STAT3的磷酸化水平，減少心肌細胞凋亡，改善心功能。表明，間歇運動改善心梗大鼠心肌細胞凋亡，發(fā)揮心臟保護效應，可能與LIF-LIFR-STAT3通路的激活有關。

4 結論

間歇運動可顯著促進心梗大鼠心肌LIF蛋白表達，激活LIF/LIFR/STAT3通路，抑制心肌細胞凋亡，改善心梗心臟病理重塑和心功能。開展運動干預缺血心臟LIF表征研究與心臟保護效應，將為心?；颊哌\動康復手段篩選提供新思路。

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Effects of Interval Exercise on the Expression of Myocardial LIF and LIFR and Cell Apoptosis in a Rat Model with Myocardial Infarction

TIAN Zhen-jun1,JIA Dan-dan1,CAI Meng-xin1,DU Shao-jun2

Objectives:This study was carried out to determine the effects of interval exercise on myocardial cell apoptosis,expression of Leukemia inhibitory factor (LIF) and its reporter in rat with myocardial infarction (MI).Methods:Adult male sprague-dawley rats,3-month old,were randomly divided into three groups:Sham-operated group (Sham),sedentary MI group (MI) and MI with interval exercise group (ME).The MI model was established by ligation of the left anterior descending(LAD) coronary artery,and rats in ME were subjected to 8 weeks interval training.Cardiac function,heart tissue remodeling and cardiomyocyte apoptosis were evaluated after the training.The expression of LIF,LIFR,p-STAT3 and STAT3 was determined in the peri-infarcted area of the left ventricle by Western Blotting or RT-qPCR.Results:MI resulted in cardiac dysfunction and myocardial fibrosis,increasing the degree of myocardial cell apoptosis.Compared with MI group,interval exercise signaficantly improved cardiac function,attenuated myocardial remodeling by reducing CVF% and inhibited cardiomyocyte apoptosis in MI rats.Meanwhile,interval exercise training up-regulated the expression of LIF protein and lif and lifr mRNA,and activated the phosphorylation of STAT3 in myocardium of MI rats.Conclusion:Interval exercise inhibits myocardial cell apoptosis,up-regulates the expression of myocardial LIFs,and activates the signaling pathway of LIF/LIFR/STAT3 after MI.

intervalexercise;myocardialinfarction;apoptosis;Leukemiainhibitoryfactor；rat;experiment

2015-04-01；

2015-11-18

國家自然科學基金資助項目(31171141)；陜西師范大學特色學科建設項目(2015-01)。

田振軍(1965-)，男，陜西綏德人，教授，博士研究生導師，主要研究方向為運動心血管生物學，E-mail：tianzj611@hotmail.com；賈單單(1989-)，女，河南漯河人，在讀碩士研究生，主要研究方向為運動心血管生物學；蔡夢昕(1987-)，女，河南商丘人，在讀博士研究生，主要研究方向為運動心血管生物學；Du Shaojun(1964-)，男，山東煙臺人，教授，博士研究生導師，主要研究方向為骨骼肌和心肌分子遺傳學，E-mail：sdu@som.umaryland.edu。

1.陜西師范大學 體育學院暨運動生物學研究所，陜西 西安 710062；2.馬里蘭大學 醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，美國 巴爾地摩 MD 21202 USA 1.Shaanxi Normal University,Xi' an 710062,China.；2.University of Maryland,Baltimore,MD 21202 USA.

1000-677X(2015)12-0034-07

10.16469/j.css.201512005

G804.7

A