李可峰,董貴俊,朱曉華,李 麗,周興忠,3,王玉站,鄭淑倩,4,葛新發(fā),韓 勇,胡一平

?

中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠DDT累積代謝、肝臟應(yīng)激及結(jié)構(gòu)影響

李可峰1,董貴俊1,朱曉華2,李 麗1,周興忠1,3,王玉站1,鄭淑倩1,4,葛新發(fā)1,韓 勇1,胡一平1

目的：研究全民健身背景下有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)持續(xù)性有機(jī)污染物代謝的影響，揭示有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)DDT在體內(nèi)累積代謝、對(duì)肝臟應(yīng)激及結(jié)構(gòu)的影響。方法：90只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(CON)、安慰劑組(PG)、有氧運(yùn)動(dòng)組(AG)、正常飼養(yǎng)DDT組(CDG)、有氧運(yùn)動(dòng)DDT組(ADG)。其中，CDG和ADG以40 mg/kg(體重)的比例喂食DDT溶液2周，ADG和AG每天以18 m/min運(yùn)動(dòng)30 min。在運(yùn)動(dòng)第15天、30天、45天后取材，經(jīng)研磨和冷凍干燥后采用氣相色譜法測(cè)定不同組織中DDT的濃度分布；采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定肝臟SOD活性、硫代巴比妥酸比色法測(cè)定肝臟MDA含量、酶速率法測(cè)試肝臟GSH-Px活性、可見(jiàn)光法測(cè)定肝臟CAT活性；HE染色肝臟組織切片、醋酸鈾和檸檬酸鉛對(duì)超微結(jié)構(gòu)染色，分別采用DP70數(shù)碼顯微鏡成像系統(tǒng)及Tecnai Spirit 120KV透射電子顯微鏡及成像系統(tǒng)觀察、拍照。結(jié)果：CDG肝臟中DDT濃度在停止喂食DDT后呈逐漸下降趨勢(shì)，而ADG中則出現(xiàn)濃度先上升后下降的趨勢(shì)。在15～30天中，ADG肝臟中DDT濃度顯著高于CDG(P<0.01)，而45天則顯著低于CDG(P<0.05)；與CDG比較，ADG心臟中DDT濃度在15天和45天時(shí)顯著升高，而30天時(shí)DDT濃度低于CDG組；CDG骨骼肌DDT濃度呈遞減趨勢(shì)，ADG中呈逐漸上升趨勢(shì)；在15～30天，ADG血液DDT濃度顯著低于CDG(P<0.01)；CDG中糞便DDT濃度呈逐漸下降趨勢(shì)，ADG中濃度呈現(xiàn)較為穩(wěn)定的趨勢(shì)。氧化應(yīng)激研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)促進(jìn)ADG中SOD活性在15～45天持續(xù)升高，且顯著性高于CDG(P<0.05)；MDA含量在15～30天內(nèi)顯著性升高(P<0.05)，但在45天時(shí)呈現(xiàn)顯著性下降(P<0.01)；GSH-Px及CAT活性15天和30天時(shí)均顯著升高(P<0.05)，在45天時(shí)則受到顯著抑制(P<0.05)。DDT攝入影響肝臟超微結(jié)構(gòu)，并隨著DDT在肝臟中積累而加重，施加有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后期能明顯改善DDT攝入引起的超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)論：中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)通過(guò)改變DDT在體內(nèi)分布，減少了DDT在肝臟中的富集，但增加了運(yùn)動(dòng)初期心臟和骨骼肌中DDT分布及DDT排出體外的速度；改善肝臟的氧化應(yīng)激狀態(tài)，特別有利于運(yùn)動(dòng)初期肝臟中氧化應(yīng)激狀態(tài)的改善；有利于DDT富集引起的肝組織結(jié)構(gòu)變化恢復(fù)。

有氧運(yùn)動(dòng)；大鼠；DDT代謝；肝臟；氧化應(yīng)激

1 前言

持續(xù)性有機(jī)污染物(Persistent Organic Pollutants，POPs)是一類對(duì)人類健康和環(huán)境具有嚴(yán)重危害的天然或人工合成的有機(jī)污染物質(zhì)，具有殘留長(zhǎng)、易蓄積、半揮發(fā)及毒性高等特點(diǎn)，其代表之一為雙對(duì)氯苯基三氯乙烷(Dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT)，其主要用于農(nóng)業(yè)的害蟲(chóng)防治及減輕瘧疾傷寒等蚊蠅傳播的疾病危害，通過(guò)食物鏈最終進(jìn)入人體[31]。DDT為脂溶性物質(zhì)，降解周期長(zhǎng)，可影響內(nèi)分泌系統(tǒng)，誘導(dǎo)肝細(xì)胞微粒體氧化酶類，可引起高血壓、肝臟腫大、癌變等危害[8，15，17，32，33]。目前，對(duì)DDT的研究主要集中在其對(duì)水域、海洋生物、微生物富集趨勢(shì)、致病特征、致死劑量、降解速度等，其代謝主要受過(guò)氧化物酶、趨磁細(xì)菌等影響[23，25]。雖然DDT的大范圍使用已得到有效控制，但由于其或其代謝產(chǎn)物在環(huán)境中殘存的持久性、毒性及在生物鏈中的累積效應(yīng)導(dǎo)致DDT長(zhǎng)時(shí)間、大范圍的傳播，因此，其對(duì)人類健康及環(huán)境的影響依然不容忽視。2014年，Hu等發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)江三角洲土壤中的DDT殘留依然主要來(lái)源于過(guò)去施用的DDT[12]。Wang等(2013)調(diào)查了海河流域及其沉積物中DDT的含量，發(fā)現(xiàn)河北省東部水域的DDT污染最為嚴(yán)重，污染源中發(fā)現(xiàn)新近使用的DDT[34]。實(shí)際上DDT在世界范圍內(nèi)并未完全被杜絕使用。由于DDT控制瘧疾的廉價(jià)及有效性，有些國(guó)家依然將DDT等POPs用于瘧疾的防治，由此更為加劇了DDT對(duì)環(huán)境及人類健康的危害[4]。據(jù)調(diào)查，北京地區(qū)300多位孕婦乳汁中有90%檢出多氯聯(lián)苯或DDT等POPs，另有10%人群體內(nèi)殘留POPs處在危險(xiǎn)水平[35]。因此，預(yù)防及干預(yù)DDT在體內(nèi)的積累已成為全民健康計(jì)劃的重要研究課題。

長(zhǎng)時(shí)間有氧運(yùn)動(dòng)能夠加速脂類代謝，提高過(guò)氧化物酶等活性，但有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)體內(nèi)DDT降解的研究尚處于探索階段[2]。Berdanier等發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)DDT誘導(dǎo)的大鼠肝臟膽固醇及血清胰島素下降具有抵制作用，增加有氧運(yùn)動(dòng)可以顯著增強(qiáng)喂養(yǎng)DDT大鼠的葡萄糖耐受力，提高免疫血清及血清胰島素的含量，從而有利于大鼠肝臟功能的恢復(fù)，但文中未涉及DDT在大鼠體內(nèi)其余臟器的分布及代謝動(dòng)力學(xué)情況[3]。本研究通過(guò)灌胃飼養(yǎng)將DDT植入大鼠體內(nèi)，研究DDT攝入后在體內(nèi)累積代謝特征，同時(shí)進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)，探討有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)DDT累積代謝特征，有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)DDT誘發(fā)的大鼠肝臟應(yīng)激狀態(tài)及結(jié)構(gòu)改變。

2 研究對(duì)象與方法

2.1 研究對(duì)象

2.2 研究方法

2.2.1 給藥方式

DDTs(p,p′-DDT，p,p′-DDE，p,p′-DDD和o,p′-DDT)標(biāo)樣購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，溶于橄欖油中待用。給藥量以40 mg/kg體重(半致死量)為標(biāo)準(zhǔn)，配制濃度為6.256 mg/mL的DDTs溶液，連續(xù)給藥2周[5,10]。

2.2.2 樣品采集

首次運(yùn)動(dòng)后15天、30天、45天采用脊柱脫臼法處死實(shí)驗(yàn)大鼠，解剖取肝臟、心臟、股四頭肌及糞便。斷頭法取血液，室溫放置30 min后4℃/4 000 rpm離心10 min，取血清，液氮速凍用于酶學(xué)指標(biāo)。心臟、股四頭肌、糞便及部分肝臟樣品于液氮凍存。部分肝臟樣品冰上低溫環(huán)境下修材，切成0.5 cm×0.5 cm×0.8 cm長(zhǎng)方體置于4%多聚甲醛固定用于組織結(jié)構(gòu)分析，部分切成1 mm×1 mm×2 mm長(zhǎng)方體置于2.5%戊二醛溶液固定用于超微結(jié)構(gòu)分析。

2.2.3 樣品DDTs濃度測(cè)定

測(cè)試方法參照Emmanuel等進(jìn)行[33]。將樣品冷凍干燥，研磨后用正己烷和丙酮混合液(體積比1∶1)于ASE300加速溶劑萃取儀(戴安科技有限公司，美國(guó))進(jìn)行萃取。萃取液濃縮后經(jīng)Florisil柱(干法裝柱，依次為2 cm的無(wú)水硫酸鈉、5 g弗羅里土及2 cm的無(wú)水硫酸鈉)凈化，第一步，10 mL正己烷洗脫，第二步，30 mL正己烷/二氯甲烷 (4∶1) 洗脫。洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，氮吹定容至1 mL，待上機(jī)分析。氣相色譜儀Agilent 6890 GC-ECD(安捷倫公司，美國(guó))在樣品測(cè)試前，進(jìn)行必要的校準(zhǔn)、核對(duì)和條件化，重復(fù)進(jìn)同一濃度標(biāo)樣5～7次，直到測(cè)定結(jié)果的RSD<5%，開(kāi)始進(jìn)行樣品測(cè)試，以確保色譜儀的準(zhǔn)確性。用保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定性，用外標(biāo)法和五點(diǎn)校正曲線進(jìn)行定量。升溫程序：HPDB-5彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 m)，初始柱溫100℃保持2 min，再以15℃/min的速度升溫至180℃，然后以5℃/min的速度升溫至300℃，保持4 min。進(jìn)樣口溫度260℃。檢測(cè)器溫度320℃。以高純氮?dú)庾鳛檩d氣，進(jìn)樣量1 μL。每批分析樣帶1個(gè)空白樣，以確認(rèn)試劑和容器的清潔程度。加標(biāo)樣：每批分析樣(約10個(gè))帶1個(gè)待測(cè)樣添加標(biāo)樣。回收率指示物PCB209的回收率為75%～109%。p,p′-DDE、p,p′-DDD、o,p′-DDT和p,p′-DDT的儀器定量限分別為0.6 pg、0.7 pg、0.5 pg和0.5 pg。

2.2.4 氧化應(yīng)激狀態(tài)相關(guān)酶指標(biāo)測(cè)定

SOD活性的測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法，GSH-Px活性測(cè)試采用酶速率法，CAT活性的測(cè)定采用可見(jiàn)光法。試劑盒由南京建成生物有限公司提供，具體測(cè)試方法參照試劑盒標(biāo)注。

2.2.5 組織石蠟切片標(biāo)本及電子顯微鏡標(biāo)本制作

固定樣品放入蘇木精染液中染色5 min，用水沖洗3 min；1%鹽酸酒精溶液分化3 s，流水沖洗3 min；伊紅染液復(fù)染2 min；按順序依次放入85%、95%、95%、100%、100%酒精中脫水、分化伊紅顏色各1 min；切片經(jīng)二甲苯透明各3 min，將載玻片取出，滴加一滴中性樹(shù)膠，加蓋玻片封片。將封好的切片置于37℃恒溫箱內(nèi)烘烤。日本OLYMPUS公司生產(chǎn)的DP70數(shù)碼顯微鏡成像系統(tǒng)觀察并拍照。

透射電子顯微鏡標(biāo)本制作組織取材，放入2.5%戊二醛溶液中(磷酸緩沖液配置)，固定2 h，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗15 min，共3次；用1%鋨酸固定液室溫下固定2 h；0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗15 min，漂洗3次；后經(jīng)乙醇脫水、包埋、聚合、切片后，用3%醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，分別染色15 min及5 min。Tecnai Spirit 120KV透射電子顯微鏡及成像系統(tǒng)觀察并拍照。

2.3 數(shù)理統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)果

3.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)DDTs在大鼠體內(nèi)分布的影響

3.1.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肝臟DDTs濃度的影響

與CON比較，PG和AG肝臟內(nèi)DDTs濃度沒(méi)有顯著性變化(P>0.05)。喂養(yǎng)DDTs兩組在15～30天內(nèi)肝臟內(nèi)DDTs濃度顯著高于CON(P<0.01)。45天時(shí)，CDG組顯著高于CON(P<0.01) 。CDG肝臟中DDTs濃度在停止喂食DDTs后逐漸下降，而ADG中濃度先上升后下降。在15～30天中ADG肝臟中DDTs濃度顯著高于CDG(P<0.01)，而45天時(shí)則顯著低于CDG(P<0.05)，說(shuō)明在喂食DDTs后，有氧運(yùn)動(dòng)早期促進(jìn)了DDTs在肝臟中的儲(chǔ)存，而有氧運(yùn)動(dòng)后期(45天)加速了DDTs在肝臟中的排出。因此，長(zhǎng)時(shí)間的有氧運(yùn)動(dòng)可以加速DDTs從大鼠肝臟中排出(表1)。

表1 本研究各組大鼠不同時(shí)間肝臟中DDTs濃度一覽表

Table 1 Liver DDTS Concentration in Different Groups(ng/g)

注：#為與CON比較 P<0.01，&為ADG和CDG比較P<0.05，@為ADG和CDG比較P<0.01，下同。

3.1.2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟中DDT濃度的影響

表2顯示，CDG、ADG中DDTs濃度先上升后下降，各時(shí)期DDTs濃度均顯著性高于CON。不同時(shí)間點(diǎn)ADG DD區(qū)濃度變化幅度小于CDG。與CDG組比較，ADG組DDTs濃度在15天和45天時(shí)顯著升高(P<0.01)，而30天時(shí)略低于CDG組。說(shuō)明，有氧運(yùn)動(dòng)能夠持續(xù)促進(jìn)DDTs在體內(nèi)的分布，特別是通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)行DDTs的再分配。

表2 本研究各組大鼠不同時(shí)間心臟中DDTs濃度一覽表

Table 2 Heart DDTS Concentration in Different Groups(ng/g)

注：*為與CON比較P<0.05，下同。

3.1.3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌中DDTs濃度的影響

骨骼肌中，CDG中DDTs濃度呈遞減趨勢(shì)，15天時(shí)顯著高于CON(P<0.01)。至30天時(shí)，CDG基本恢復(fù)到正常水平，和CON比較不具有顯著性差異(P>0.05)。ADG中DDTs濃度呈逐漸上升趨勢(shì)，15～45天中DDTs濃度逐漸升高，和CON比較具有顯著性差異。與CDG濃度比較研究發(fā)現(xiàn)，15天時(shí)ADG中DDTs濃度顯著下降(P<0.01),而在30～45天時(shí)ADG中DDTs濃度顯著上升(P<0.01)，說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)使體內(nèi)DDTs向骨骼肌轉(zhuǎn)移(表3)。

表3 本研究各組骨骼肌中DDTs濃度一覽表

Table 3 Skeletal Muscle DDTS Concentration in Different Groups (ng/g)

15天30天45天CON658.4±234.2679.5±229.4667.3±228.3PG671.4±227.3655.2±235.2683.2±231.1AG650.1±223.9666.3±233.8662.7±226.3CDG3088.1±389.3#651.3±237.3388.8±226.3ADG1162.6±272.3*@1285.2±129.2#@1970.4±332.5#@

3.1.4 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)血液中DDTs濃度的影響

表4所示，CDG和ADG 15～45天期間，DDTs濃度均顯著高于CON，表明DDTs大量進(jìn)入血液。對(duì)比CDG和ADG中DDT濃度發(fā)現(xiàn)，在15～30天期間，ADG組DDT濃度顯著低于CDG(P<0.01)，且ADG中DDTs濃度變化幅度明顯小于CDG，表明有氧運(yùn)動(dòng)有利于抑制血液中DDTs濃度快速上升。

表4 本研究各組大鼠不同時(shí)間血液中DDTs濃度一覽表

Table 4 Blood DDTS Concentration in Different Groups(ng/g)

15天30天45天CON4.2±1.24.7±0.94.5±1.1PG4.4±1.04.1±1.34.6±1.5AG4.9±1.44.3±0.94.8±1.2CDG69.2±9.3#449.8±54.1#26.7±7.8#ADG21.4±7.3#@27.4±8.1#@22.3±6.2#

3.1.5 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糞便中DDTs濃度的影響

表5顯示，CDG和ADG糞便中DDTs濃度變化未表現(xiàn)出一致規(guī)律。CDG中糞便DDTs濃度呈逐漸下降趨勢(shì)，表明隨著DDTs對(duì)大鼠機(jī)體的毒性發(fā)作，其機(jī)體排出DDTs的能力逐漸下降。ADG糞便中DDTs濃度呈現(xiàn)較為穩(wěn)定的趨勢(shì)，特別是45天時(shí)DDTs濃度顯著高于CDG(P<0.01)，表明有氧運(yùn)動(dòng)能夠使大鼠體內(nèi)DDTs均勻排出，減少DDTs濃度急性變化對(duì)機(jī)體應(yīng)激代謝能力的影響。

表5 本研究各組大鼠不同時(shí)間糞便中DDTs濃度一覽表

Table 5 Excrement DDTS Concentration in Different Groups(ng/g)

15天30天45天CON567.2±123.1583.7±145.2554.4±141.3PG563.2±132.6579.8±126.9543.6±119.4AG596.1±121.3552.4±152.3563.2±128.8CDG7217.4±4131.1#4444.8±2705.6#1921.2±787.5#ADG4827.6±3930.7#&2389.4±541.3#&4388.4±5041.5#@

3.2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)喂養(yǎng)DDTs大鼠肝臟氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響

3.2.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)喂養(yǎng)DDTs大鼠肝臟內(nèi)SOD活性的影響

有氧運(yùn)動(dòng)能使SOD活性升高，在15天時(shí)CON和AG相比，AG中SOD活性顯著升高(P<0.05)，至30～45天時(shí)SOD活性持續(xù)升高。喂養(yǎng)DDTs后，CDG中SOD活性下降，在30天時(shí)與CON中SOD活性相比顯著性下降(P<0.05)，隨后45天時(shí)SOD活性出現(xiàn)上升，但均低于同時(shí)間CON中SOD活性。與CDG中SOD活性比較，ADG在此期間持續(xù)升高，且在30天和45天時(shí)顯著性高于CDG(P<0.05)，表明有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)喂養(yǎng)DDTs大鼠肝臟中SOD活性表現(xiàn)出顯著激活作用(表6)。

表6 本研究各組大鼠不同時(shí)間肝臟內(nèi)SOD活性變化一覽表

Table 6 Rat Liver SOD Activities in Different Groups at Different Time(U/mg prot)

注：§為與AG比較P<0.05，※為與AG比較P<0.01，下同。

3.2.2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)喂養(yǎng)DDTs大鼠肝臟內(nèi)MDA含量的影響

與CON比較，AG 15天時(shí)MDA含量顯著性升高(P<0.05)，30天時(shí)繼續(xù)升高(P<0.01)，至45天時(shí)逐漸下降至CON水平(P>0.05)，表明正常大鼠肝臟在45天內(nèi)逐漸適應(yīng)有氧運(yùn)動(dòng)刺激。在喂養(yǎng)DDTs大鼠中，CDG中MDA含量在15天時(shí)與CON比較顯著性升高(P<0.01)，此后持續(xù)上升，至45天時(shí)表現(xiàn)為最大值。與CDG比較，ADG中MDA含量在15～30天內(nèi)顯著性升高，45天時(shí)呈現(xiàn)顯著性下降，但仍顯著性高于CON中MDA含量(P<0.01)，表明有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)于喂養(yǎng)DDTs大鼠肝臟中MDA的產(chǎn)生在早期具有一定的刺激作用，在30天后表現(xiàn)為一定的抑制作用。因此，長(zhǎng)時(shí)間有氧運(yùn)動(dòng)有效降低DDTs在肝臟內(nèi)積累引起的氧化損傷(表7)。

表7 本研究各組大鼠不同時(shí)間肝臟內(nèi)MDA含量變化一覽表

Table 7 Rat Liver MDA Contents in Different Groups at Different Time(mmol/mg prot)

15天30天45天CON0.92±0.070.91±0.080.92±0.10PG0.91±0.050.92±0.100.91±0.08AG1.15±0.19*1.57±0.09#0.93±0.09CDG1.95±0.12#§2.67±0.11#※2.92±0.09#※ADG2.23±0.12#※&3.21±0.09#§@2.58±0.08#※@

3.2.3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)喂養(yǎng)DDTs大鼠肝臟內(nèi)GSH-Px活性的影響

有氧運(yùn)動(dòng)可以誘導(dǎo)AG中GSH-Px活性逐漸增高，但在15天時(shí)與CON比較并未發(fā)現(xiàn)顯著性差異，至30～45天時(shí)顯著高于CON(P<0.05)。CDG中，喂養(yǎng)DDTs在15天時(shí)誘導(dǎo)GSH-Px活性增高，至30天時(shí)顯著性高于CON(P<0.05)，此后酶活性下降至正常水平。喂養(yǎng)DDTs后施加有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)在運(yùn)動(dòng)早期(15天、30天)能顯著性提高GSH-Px活性，其中，15天時(shí)顯著性高于CON(P<0.05),30天時(shí)活性繼續(xù)提高(P<0.01)，至45天時(shí)活性下降至正常水平，顯著性低于AG(P<0.05，表8)。

表8 本研究各組大鼠不同時(shí)間肝臟內(nèi)GSH-Px活性變化一覽表

Table 8 Rat Liver GSH-Px Activities in Different Groups at Different Time(U/mg prot)

15天30天45天CON151.58±14.27149.43±16.65152.73±13.87PG149.63±15.39150.59±24.99148.28±16.81AG173.66±27.37196.36±23.89*194.92±17.42*CDG185.33±18.47194.39±19.12*169.27±24.17ADG199.32±17.72*227.55±24.94#157.64±25.92§

3.2.4 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)喂養(yǎng)DDTs大鼠肝臟內(nèi)CAT活性的影響

與CON相比，喂食DDTs后，ADG在15天和30天時(shí)CAT活性存在顯著性差異，但至45天時(shí)未表現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明在15～30天期間，有氧運(yùn)動(dòng)能有效提高CAT活性，即有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)喂養(yǎng)DDTs大鼠肝臟的過(guò)氧化氫酶活性在喂養(yǎng)結(jié)束前期具有一定的刺激作用(表9)。

表9 本研究各組大鼠肝臟內(nèi)不同時(shí)間CAT活性變化一覽表

Table 9 Rat Liver CAT Activities in Different Groups at Different Time(U/mg prot)

15天30天45天CON38.49±3.9737.82±3.4238.13±4.37PG39.12±2.6138.84±3.1838.89±2.76AG43.79±2.4248.74±2.63*37.95±3.27CDG49.23±4.1256.93±3.32#45.46±3.77ADG53.21±2.47*§62.46±3.39#§42.23±4.11

3.3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)喂養(yǎng)DDTs大鼠肝臟的影響

3.3.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)喂養(yǎng)DDTs大鼠肝臟重量的影響

與CON比較，ADG和CDG肝臟重量在15天時(shí)并未出現(xiàn)顯著性變化(P>0.05)。隨著喂養(yǎng)DDTs時(shí)間的延長(zhǎng)，至30天時(shí)CDG肝臟重量達(dá)到14.98 g，顯著性高于CON及ADG(P<0.05)。45天時(shí)，CDG肝臟重量顯著高于CON和ADG(P<0.01)，而ADG與CON之間未表現(xiàn)出顯著差異性(表10)。

表10 本研究大鼠肝臟重量的變化一覽表

Table 10 Changes of Rat Liver Weight(g)

CONCDGADG15天Body280.00±1.41282.50±0.71281.50±1.32Liver14.13±0.2514.17±0.1914.16±0.1630天Body335.00±1.46339.50±2.12*336.00±2.58Liver14.24±0.1314.98±0.17&*14.21±0.1845天Body373.00±3.56&389.50±2.09#384.00±2.14Liver14.23±1.0619.67±0.68@#14.22±0.22

3.3.2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)喂養(yǎng)DDTs大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)影響

CON：15天、30天、45天中HE組織切片未發(fā)現(xiàn)異常，肝組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞無(wú)脂肪變性、細(xì)胞質(zhì)豐富、細(xì)胞核位于細(xì)胞中央(圖1C)。

CDG：喂食DDTs后，肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)充滿大小不等的脂肪油滴顆粒，肝細(xì)胞內(nèi)大脂滴將細(xì)胞核擠向一側(cè)，少數(shù)肝細(xì)胞出現(xiàn)水樣變性。肝臟細(xì)胞出現(xiàn)纖維化的趨勢(shì)(圖1B)。

ADG：大鼠喂食DDTs經(jīng)有氧運(yùn)動(dòng)后，脂肪顆粒逐漸減少，至45天時(shí)大部分細(xì)胞接近正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)，受DDTs毒害作用引起的局部細(xì)胞纖維化現(xiàn)象也逐漸的消失(圖1A)。

3.3.3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)喂養(yǎng)DDTs大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)影響

CON(圖2)：大鼠肝臟細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)完整，并呈橢圓形或圓形；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，平行排列，線粒體內(nèi)基質(zhì)較多、峭呈管狀，清晰可見(jiàn)(圖2：C1、C2)；細(xì)胞核完整呈橢圓形，含有彌散的染色質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器較豐富、細(xì)胞膜未見(jiàn)破損、線粒體分布較密集且完好無(wú)損、數(shù)個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集在一起鑲嵌在線粒體周圍、細(xì)胞質(zhì)間有少量脂滴分布(圖2：C3、C4、C5、C6)；表面微絨毛分布密集，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上核糖體分布較多，細(xì)胞質(zhì)間有較多糖原分布(圖2：C7、C8)。

圖1 本研究大鼠肝臟HE染色后組織結(jié)構(gòu)圖

圖2 本研究CON大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)圖

CDG(圖3)：喂食DDTs至15天后大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)與正常大鼠肝臟相比，細(xì)胞核完整、呈長(zhǎng)橢圓形，含有彌散的染色質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器排列更整齊緊密(B1-1、B1-2、B1-4，×6 000)；出現(xiàn)數(shù)量不多的凋亡小體(黑色箭頭所示B1-3，×6 000)；細(xì)胞間有大量膠原出現(xiàn)(白色箭頭所示B1-5、B1-6，×12 000)。30天時(shí)，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，出現(xiàn)大量的凋亡小體(B2-1、B2-2、B2-3，×15 000)，肝臟細(xì)胞變形，細(xì)胞界限不清，線粒體出現(xiàn)腫脹、模糊不清，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多的脂滴(B2-4、B2-5，×15 000)。45天時(shí)，肝臟細(xì)胞損傷比較嚴(yán)重，細(xì)胞體積縮小，線粒體腫脹、嵴消失，并且分布不均勻，出現(xiàn)空泡(B3-1、B3-3、B3-4、B3-5、B3-7，×12 000)；出現(xiàn)髓樣小體(紅色箭頭所示，B3-2、B3-6，×25 000)。

圖3 本研究CDG不同時(shí)間大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)圖

ADG(圖4)：喂食DDTs后進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)15天時(shí)大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)中，凋亡小體出現(xiàn)(黑色箭頭所示)，但數(shù)量較少(A1-1，×15 000)，存在少量脂滴，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的腫脹較輕，細(xì)胞基質(zhì)稀薄，細(xì)胞質(zhì)膜破損，肝竇紊亂(A1-2、A1-3、A1-4、A1-5，×6 000)。30天時(shí)，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等損傷明顯減輕，同時(shí)部分線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的質(zhì)膜有融合的現(xiàn)象，染色質(zhì)凝集情況已有明顯好轉(zhuǎn)的跡象(A2-1、A2-2、A2-3、A2-4、A2-5，×12 000)；45天時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本清晰，線粒體微度腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒較輕，脂滴和膽管微絨毛脫失減少，核皺縮和染色質(zhì)凝集均較DDT實(shí)驗(yàn)組有明顯改善，大部分細(xì)胞基本恢復(fù)正常，少數(shù)仍出現(xiàn)脂滴現(xiàn)象(A3-1、A3-3、A3-4、A3-5，×15 000)與此同時(shí)，出現(xiàn)明顯的糖原顆粒，可能是在運(yùn)動(dòng)代謝時(shí)分解產(chǎn)生(A3-2，×12 000)。

4 討論

4.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠DDTs在體內(nèi)分布及排泄的影響

DDT作為脂溶性物質(zhì)，其在體內(nèi)儲(chǔ)存與運(yùn)輸主要隨脂肪的代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行。通常在機(jī)體內(nèi)器官中，肝臟是主要的DDTs儲(chǔ)存器官，其次，皮下脂肪、大腦、心臟、血液、皮膚等也有檢出[23]。本研究中，在大鼠肝臟、心臟、骨骼肌、血液、糞便等均檢出不同濃度的DDTs，表明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中DDT攝入后被分配到大鼠不同器官。生物體在常態(tài)下DDTs的積累趨于動(dòng)態(tài)平衡，即在同一生活環(huán)境下各個(gè)臟器中分布相對(duì)固定[24]。本研究CON中DDTs濃度在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中基本穩(wěn)定，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠基本未受到外界影響，DDTs測(cè)試方法穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)中，2周內(nèi)灌胃DDTs后，大鼠體內(nèi)DDTs濃度出現(xiàn)較大幅度波動(dòng)，從而CDG中肝臟、心臟、血液、骨骼肌及糞便中DDTs濃度均出現(xiàn)顯著性升高。進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，不同組織DDTs濃度變化的規(guī)律不盡相同。CDG肝臟中DDTs濃度在停止喂食DDTs后呈逐漸下降趨勢(shì)，而ADG中則出現(xiàn)濃度先上升后下降的趨勢(shì)，至運(yùn)動(dòng)后期出現(xiàn)DDTs顯著下降，說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)初期促進(jìn)了DDTs在肝臟中的儲(chǔ)存，而運(yùn)動(dòng)后期則促肝臟中DDTs的轉(zhuǎn)運(yùn)，這可能是長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)促進(jìn)肝臟增加肝糖原儲(chǔ)備、分解肝臟中脂肪儲(chǔ)備，從而加速了DDTs的降解[9，26]。心臟中DDTs濃度變化趨勢(shì)表現(xiàn)為先上升再下降，但是施加有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后DDTs濃度變化幅度小于直接喂食DDTs組，表明有氧運(yùn)動(dòng)可以降低心臟中DDTs濃度的劇烈波動(dòng)，促進(jìn)血液循環(huán)進(jìn)行DDTs的再分配。隨著有氧運(yùn)動(dòng)的進(jìn)行，骨骼肌中DDTs濃度呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，特別是運(yùn)動(dòng)后期顯著高于CDG組，表明有氧運(yùn)動(dòng)促進(jìn)提高骨骼肌中氧飽和度，從而利于DDT在有氧環(huán)境下轉(zhuǎn)化為DDE[6，21,28]。DDT在環(huán)境中的主要降解產(chǎn)物為DDE，少量為DDD。通常認(rèn)為，在需氧條件下DDT可被脫氯化氫轉(zhuǎn)化為DDE，而在厭氧條件一則可以脫氯降解為DDD。DDE基本沒(méi)有活性，因此被認(rèn)為是DDT降解的最終產(chǎn)物。血液中DDTs濃度變化顯示，有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)于抑制血液中DDTs濃度的快速上升具有一定的作用，說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)加速血液中DDTs的轉(zhuǎn)移及降解。CDG中糞便DDTs濃度呈逐漸下降趨勢(shì)，表明隨著DDTs對(duì)大鼠機(jī)體的毒性發(fā)作，其機(jī)體排出DDTs的能力逐漸下降；而ADG糞便中DDTs濃度呈現(xiàn)較為穩(wěn)定的趨勢(shì)，特別是有氧運(yùn)動(dòng)后期DDTs排出量逐漸升高，表明有氧運(yùn)動(dòng)能夠使大鼠體內(nèi)DDT均勻排出，減少DDT濃度急性變化對(duì)機(jī)體的危害。

圖4 本研究ADG不同時(shí)間大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)圖

有氧運(yùn)動(dòng)在運(yùn)動(dòng)初期能夠加速DDTs在肝臟中的富集，減少體內(nèi)DDTs濃度升高過(guò)快造成的影響，而在運(yùn)動(dòng)后期能夠加速DDTs從肝臟轉(zhuǎn)移至其他器官，從而使DDTs在骨骼肌等器官中被降解、排出。因此，有氧運(yùn)動(dòng)通過(guò)改變DDTs在體內(nèi)富集、轉(zhuǎn)移等過(guò)程，改變了體內(nèi)各器官中DDTs的分布，減少DDTs在肝臟內(nèi)的富集，增加DDTs降解和排出的速度。

4.2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)喂養(yǎng)DDT大鼠肝臟氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境污染物可以影響諸多環(huán)境標(biāo)記物的濃度。DDTs污染后通?？梢韵腟OD、CAT等環(huán)境中的過(guò)氧化物相關(guān)酶類從而生成最終代謝產(chǎn)物MDA，因此，MDA常作為環(huán)境污染中重要的生物標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)[7,16]。SOD、CAT及GSH-Px等活性的變化具有組織特異性[19,20]。

本研究中，對(duì)喂養(yǎng)DDTs大鼠肝臟的氧化應(yīng)激狀態(tài)進(jìn)行分析，并通過(guò)施加有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)，分析有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)于DDTs引起的大鼠肝臟氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DDTs能迅速持續(xù)性增加大鼠肝臟中MDA的積累，表明DDTs的攝入導(dǎo)致大鼠肝臟中脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)加劇[18,22]。有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)于MDA的產(chǎn)生在運(yùn)動(dòng)早期(15～30天)具有一定的刺激作用，在30天后表現(xiàn)為抑制作用，表明長(zhǎng)時(shí)間有氧運(yùn)動(dòng)有效降低DDT在肝臟內(nèi)積累引起的氧化損傷。有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，引起大鼠肝臟SOD、CAT、GSH-Px活性不同程度的上升，但是規(guī)律不盡相同。SOD活性變化主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)后期30～45天，而CAT、GSH-Px活性升高主要出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)前期15～30天，表明有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性提高表現(xiàn)出一定的時(shí)序性。

4.3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)喂養(yǎng)DDT大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)影響

DDT攝入影響肝臟超微結(jié)構(gòu)，這種影響隨著DDTs在肝臟中積累的數(shù)量而加重，施加有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，在初期對(duì)超微結(jié)構(gòu)改變情況不明顯，但是后期(45天)能明顯改善DDTs攝入引起的超微結(jié)構(gòu)的變化，說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)DDTs攝入引起的超微結(jié)構(gòu)的變化具有改善作用。

5 結(jié)論

1.中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)通過(guò)改變DDT在體內(nèi)分布，減少了DDT在肝臟中的富集，但增加了運(yùn)動(dòng)初期心臟和骨骼肌中DDT分布，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后期DDT排出體外的速度。

2.中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)可改善肝臟的氧化應(yīng)激狀態(tài)，有利于提高運(yùn)動(dòng)過(guò)程中SOD活性，提高運(yùn)動(dòng)初期肝臟中GSH-Px、CAT活性，在運(yùn)動(dòng)晚期有利于降低MDA的含量。

3.中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)能有效降低由于DDT攝入導(dǎo)致的肝組織腫大，有利于恢復(fù)DDT富集引起的肝組織結(jié)構(gòu)變化。

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The Changes of DDT Accumulation Metabolism,Liver Oxidative Stress and Structure Intervened by Moderate Intensity Exercise

LI Ke-feng1,DONG Gui-jun1,ZHU Xiao-hua2,LI Li1,ZHOU Xing-zhong1,3,WANG Yu-zhan1,ZHENG Shu-qian1,4,GE Xin-fa1,HAN Yong1,HU Yi-ping1

Objective:To reveal the influence of aerobic exercise on DDT accumulation metabolic rules,changes of oxidative stress and structure in liver induced by DDT under the background of national fitness.Methods:90 male Wistar rats were randomly assigned into control group (CON),placebo group (PG),aerobic exercise group (AG),CON with DDT group (CDG) and aerobic exercise with DDT group (ADG).CDG and ADG were fed with DDT solution according to 40 mg/kg body weight for 2 weeks;ADG and AG were exercised with 18 m/min speed movement for 30 min every day.During 15d,30d and 45d after exercise,DDT concentration was investigated by gas chromatography after grinding and freeze-drying and the distribution of DDT in different organizations were studied;the activities of SOD,GSH-Px and CAT were evaluated by xanthine oxidase method,enzyme kinetic method and visible light method respectively,the MDA content was determined with glucosinolates barbituric acid colorimetric method.The live samples were stained with HE for liver biopsy,and uranium acetate,citrate for liver ultrastructure,then observed and took photos with DP70 digital microscope imaging system and Tecnai Spirit transmission electron microscope and imaging system (120 kv).Results:DDT concentrations decreased gradually in CDG liver,whereas it rose first and then fell in ADG liver.DDT concentrations in ADG liver were significantly higher than that in CDG from 15d to 30d (P<0.01),and lower than the CDG at 45d (P<0.05).Compared with the CDG,DDT concentrations in ADG heart showed a significant rise at 15d and 45d,and a significant decline at 30d.DDT concentrations in CDG skeletal muscle decreased gradually but rose in ADG.From 15d to 30d,DDT concentrations in ADG blood was significantly lower than that in CDG(P<0.01).DDT concentrations in CDG feces declined gradually but were relatively stable in ADG feces.Aerobic exercise can promote SOD activity in ADG from 15d to 45d which was significantly higher than that of the CDG (P<0.05),increase MDA content within 15-30d significantly (P<0.05) and decline it significantly after 30d (P<0.05),activate GSH-Px and CAT activity within 15d and 30d after feeding DDT(P<0.05) and inhibit it significantly at 45d (P<0.05).DDT intake affected liver ultrastructure,and the damage was aggravating with the accumulation of DDT.The changes of ultrastructure induced by DDT accumulation could be improved with aerobic exercise intervention (45d).Conclusion:Aerobic exercise can change the distribution of DDT in rats,reduce the concentration of DDT in liver,but increase the DDT distribution in heart and skeletal muscle during the early exercise period and increase the speed of DDT discharge for a long time exercise;Aerobic exercise can improve liver oxidative stress,particularly benefit the changes of oxidative stress at the early movement.Aerobic exercise is conducive to tissue recovery induced by the DDT enrichment.

aerobicexercise;rat;DDTmetabolism;liver;oxidativestress

2015-05-11；

2015-10-26

山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目(J12LE04)。

李可峰(1978-)，女，山東即墨人，副教授，博士，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)訓(xùn)練適應(yīng)的分子機(jī)制，Tel：(0531)89655085，E-mail:jmlikefeng@163.com；董貴俊(1978-)，男，山東莒縣人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與慢性病的分子機(jī)制，Tel：(0531)89655058，E-mail:donggj@163.com。

1.山東體育學(xué)院，山東 濟(jì)南 250102；2.國(guó)家地質(zhì)實(shí)驗(yàn)測(cè)試中心，北京 100037；3．山東華宇工學(xué)院，山東 德州 253034；4．濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 262500 1.Shandong Sport University,Jinan 250102,China；2.National Research Center for Geoanalysis,Beijing 100037,China；3.Shandong Huayu University of Technology,Dezhou 253034,China；4.Weifang Nursing Vocational College,Weifang 262500,China.

1000-677X(2015)12-0041-11

10.16469/j.css.201512006

G804.7

A