李建龍,劉書亮,*,彭 楊,劉 軍,楊 勇,韓新鋒,侯曉艷,夏小龍,羅佩文,賈秋思

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014;2.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川自貢 643000;3.四川保寧醋有限公司,四川閬中 645000)

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HPLC法同時(shí)檢測(cè)食醋中川芎嗪和阿魏酸的含量

李建龍1,劉書亮1,*,彭 楊1,劉 軍2,楊 勇3,韓新鋒1,侯曉艷1,夏小龍1,羅佩文1,賈秋思1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014;2.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川自貢 643000;3.四川保寧醋有限公司,四川閬中 645000)

本文建立了一種高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)食醋中川芎嗪和阿魏酸的方法,其檢測(cè)條件為:采用Sepax GP-C18柱,流動(dòng)相:甲醇∶水(含0.2%冰乙酸)=23∶77(v/v),檢測(cè)波長(zhǎng)310nm,柱溫35℃,進(jìn)樣量10μL,1.0mL/min等梯度洗脫。結(jié)果表明:川芎嗪在1.00～60.00μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2=0.990,保留時(shí)間為14.71min;而阿魏酸在1.00～15.00μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為R2=0.997,保留時(shí)間為19.45min;該方法檢測(cè)川芎嗪和阿魏酸的檢出限分別為0.115、0.041μg/mL,測(cè)定限分別為0.383、0.135μg/mL;加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果得出川芎嗪的平均回收率為100.01%,阿魏酸的平均回收率為99.85%。該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確,樣品前處理簡(jiǎn)便,可應(yīng)用于食醋產(chǎn)品中川芎嗪和阿魏酸檢測(cè)。

高效液相色譜法,阿魏酸,川芎嗪,食醋

食醋是日常生活中重要的調(diào)味品,其在我國(guó)的飲食文化中地位頗高,隨著對(duì)食醋的深入研究,現(xiàn)已確定了食醋中含有相當(dāng)豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如蛋白質(zhì)、氨基酸和碳水化合物(葡萄糖、麥芽糖等),其有機(jī)酸含量也較為豐富(除乙酸外,還有乳酸、檸檬酸、丙酮酸及琥珀酸等),同時(shí)食醋還含有維生素和礦物質(zhì)[1-5]。近年來(lái),科研人員對(duì)食醋中功能成分的研究日益加強(qiáng),其中對(duì)川芎嗪(四甲基吡嗪,C8H12N2,Tetramethylpyrazine,TMP)和阿魏酸(又名肉桂酸,4-羥基-5-甲氧基苯丙酸,C10H10O4,Ferulic acid)等物質(zhì)的研究較為深入[6-8]。川芎嗪和阿魏酸是已知的食醋中重要的風(fēng)味物質(zhì)[1,8-9],川芎嗪還作為食品添加劑,應(yīng)用于相關(guān)加工食品中。阿魏酸和川芎嗪都具有抗血小板聚集,緩解血管痙攣,增加冠脈流量,改善微循環(huán)及增加腦血流量等作用[10-11]。

研究表明川芎嗪、阿魏酸已經(jīng)成為食醋成分中的功能指標(biāo)[12-13]。關(guān)于食醋中川芎嗪和阿魏酸的檢測(cè)方法主要有薄層洗脫比色法[14]、薄層顯色掃描法[15]及高效液相色譜法(HPLC)[16-18]等,且國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道多為測(cè)定一種成分含量方法,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,因此,建立一種同時(shí)檢測(cè)食醋中川芎嗪、阿魏酸的方法非常必要。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

特級(jí)保寧醋 市售;川芎嗪、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海金穗生物科技有限公司(98%);甲醇(色譜純) 廣東光華科技股份有限公司。

其它試劑均為分析純。LC-10A2010C HT型液相色譜儀、LC-solution工作站 日本島津公司;AS10200A超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯公司;Milli-Q超純水儀 美國(guó)密理博公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 待測(cè)樣品的提取 精確量取食醋5mL置于100mL具塞三角瓶中,用NaOH溶液調(diào)pH至8.5,按1∶4的比例加入40%乙醇提取溶劑。超聲提取45min(40kHz,100W,40℃)[19],混勻后取5mL離心(12000r/min,10min),將上清液用有機(jī)相濾膜(0.45μm)過(guò)濾,棄去初濾液2mL,取續(xù)濾液0.5mL供高效液相色譜儀分析用[20]。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為Sepax GP-C18柱(150mm×4.60mm,5.0μm);流動(dòng)相:甲醇∶水(0.2%冰乙酸)=23∶77(v/v);流速:1mL/min;柱溫:35℃;紫外檢測(cè)器,波長(zhǎng):310nm;進(jìn)樣量:10μL。

1.2.3 樣品的同步提取 川芎嗪是脂溶性物質(zhì),易溶于熱水、石油醚,溶于氯仿、乙醇,稀鹽酸,微溶于乙醚,不溶于冷水;阿魏酸易溶于熱水,難溶于苯和石油醚[21]。由于兩者都溶于乙醇,且乙醇方便易得,無(wú)毒無(wú)害[22],故采用乙醇作為提取溶劑;川芎嗪和阿魏酸易溶于熱水,故提取過(guò)程在熱水中進(jìn)行,考察在20、40、60℃下樣品的回收率,并在處理樣品時(shí)探索在酸性和堿性環(huán)境下HPLC色譜圖中雜質(zhì)峰的數(shù)量,以此確定樣品的同步提取的條件。

1.2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 用甲醇(色譜純)分別將川芎嗪和阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶解,制成質(zhì)量濃度約為10μg/mL的溶液,在200～400nm的波長(zhǎng)范圍進(jìn)行紫外光全波長(zhǎng)掃描。

1.2.5 流動(dòng)相的選擇 阿魏酸為酸性化合物,易電離,在流動(dòng)相中加入少量酸,可改善峰形,川芎嗪雖為堿性化合物,遇酸成鹽,造成拖尾現(xiàn)象,但在酸性環(huán)境中的分離效果較好[19-20]。考察四種流動(dòng)相甲醇∶水、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.1%冰乙酸)、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.5%冰乙酸)對(duì)阿魏酸和川芎嗪分離的影響(分配比為60∶40,v/v)[16],選擇基線平穩(wěn)、分離度好的流動(dòng)相做進(jìn)一步研究。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精確稱取川芎嗪、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品1mg,用1mL甲醇(色譜純)溶解,并分別配制成川芎嗪、阿魏酸濃度為60μg/mL和20μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液,將川芎嗪儲(chǔ)備液稀釋成濃度為60、50、25、12.5、10、5.0、1.0μg/mL,阿魏酸儲(chǔ)備液稀釋成濃度為15、10、5、3.3、2.5、2.0、1.0μg/mL,得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品供試液。用有機(jī)相濾膜(0.45μm)過(guò)濾,-4℃保存待用。按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定,分別以川芎嗪和阿魏酸質(zhì)量濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

1.2.7 檢出限和測(cè)定限 檢出限(detection limit)和測(cè)定限(determination limit)是對(duì)一種檢測(cè)方法評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。分別精確吸取儲(chǔ)備液,將川芎嗪儲(chǔ)備液稀釋成濃度為0.01、0.02、0.04、0.06.0.08、0.10、0.20μg/mL,阿魏酸儲(chǔ)備液稀釋成濃度為0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、1.00μg/mL,按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定。噪音值(S/N)=3時(shí)的濃度是檢測(cè)限,噪音值(S/N)=10時(shí)的濃度為測(cè)定限。

1.2.8 精密度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別精確吸取儲(chǔ)備液,將川芎嗪儲(chǔ)備液稀釋成濃度為30.0μg/mL,阿魏酸儲(chǔ)備液稀釋成濃度為3.0μg/mL,連續(xù)進(jìn)樣5次,按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定,用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示精密度。

穩(wěn)定性包括日內(nèi)穩(wěn)定性和日間穩(wěn)定性,在日內(nèi)(間隔4h)、日間(間隔1d)檢測(cè)混合標(biāo)準(zhǔn)液(川芎嗪30μg/mL;阿魏酸3μg/mL)中各物質(zhì)的質(zhì)量濃度,按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定,分析實(shí)際檢測(cè)到的質(zhì)量濃度,用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示穩(wěn)定性。

1.2.9 樣品的測(cè)定和回收率實(shí)驗(yàn) 根據(jù)以上樣品的處理?xiàng)l件及檢測(cè)方法對(duì)食醋樣品進(jìn)行處理和檢測(cè);回收率是以實(shí)際檢測(cè)樣品添加標(biāo)準(zhǔn)品后回收來(lái)進(jìn)行考察,精確量取食醋5mL置于100mL具塞三角瓶中,分別向三角瓶中加入適量川芎嗪和阿魏酸儲(chǔ)備液,川芎嗪的加標(biāo)水平為20、30、40、50、60μg/mL,阿魏酸的加標(biāo)水平為6.0、8.0、10.0、12.0、14.0μg/mL,每個(gè)水平設(shè)3個(gè)重復(fù),按上述樣品處理方法制備樣品,根據(jù)以上檢測(cè)方法測(cè)定川芎嗪和阿魏酸的質(zhì)量濃度。

回收率(%)=(Cn-Co)/W×100

式中：Cn-添加標(biāo)準(zhǔn)樣品后樣品中檢測(cè)的質(zhì)量濃度(μg/mL);Co-未添加標(biāo)準(zhǔn)品中樣品的檢測(cè)的質(zhì)量濃度(μg/mL);W-標(biāo)準(zhǔn)品的添加量(μg/mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 川芎嗪和阿魏酸的同步提取

通過(guò)比較20、40、60℃下超聲同步提取川芎嗪和阿魏酸,發(fā)現(xiàn)在40℃時(shí)兩種物質(zhì)回收率最高,且曾有報(bào)道稱[23-24],川芎嗪和阿魏酸在高溫下極易損失,應(yīng)盡量避免高溫,而提取溶劑乙醇在高溫下?lián)]發(fā)性極強(qiáng),綜上所述采用40℃提取為宜;阿魏酸存在順?lè)词浇Y(jié)構(gòu),反式結(jié)構(gòu)在一定時(shí)間內(nèi)會(huì)轉(zhuǎn)化為順式結(jié)構(gòu),且得到本實(shí)驗(yàn)證實(shí),所以樣品要在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行處理;將食醋樣品堿化可以使樣品中的其它酸類形成鹽類,且阿魏酸和川芎嗪在堿性條件下更穩(wěn)定,有利于提取,在該體系下通過(guò)超聲作用于樣品使阿魏酸和川芎嗪更易溶解在溶劑中,提高了目標(biāo)物質(zhì)的提取率,為之后的色譜分離提供條件。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

波長(zhǎng)的掃描結(jié)果見(jiàn)圖1。由于流動(dòng)相甲醇在200nm的紫外吸收信號(hào)較強(qiáng),會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的基線干擾,且從光譜圖中看出,川芎嗪和阿魏酸的最大吸收波長(zhǎng)分別為296nm和320nm,兼顧兩者,選擇310nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 川芎嗪和阿魏酸對(duì)照品吸收光譜Fig.1 UV spectrum of tetramethylpyrazine and ferulic acid standard

2.3 流動(dòng)相的選擇

分析四種流動(dòng)相甲醇∶水、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.1%冰乙酸)、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)、甲醇∶冰乙酸水溶液(0.5%冰乙酸)對(duì)阿魏酸和川芎嗪分離的影響,結(jié)果表明甲醇∶冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)和甲醇∶冰乙酸水溶液(0.5%冰乙酸),洗脫峰型良好且基線平穩(wěn),優(yōu)于其它流動(dòng)相,但考慮到較高濃度的冰乙酸會(huì)對(duì)色譜系統(tǒng)造成一定的損害,故選擇甲醇∶冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)作為流動(dòng)相。通過(guò)對(duì)比不同甲醇-冰乙酸水溶液分配比(20%、23%、26%,v/v)下的色譜圖(圖2～圖4),得出分配比為23%時(shí)色譜圖分離性較好,且出峰時(shí)間適宜,避開(kāi)了樣品中雜質(zhì)峰的影響,因此選擇甲醇-冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)的分配比23%。

圖2 20%分配比下標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的HPLC色譜圖Fig.2 The chromatogram of standard sample and vinegar sample in 20% distribution ratio注:A-川芎嗪;B-阿魏酸;C-食醋樣品;D-食醋樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)品的樣品;E-川芎嗪和阿魏酸的混合標(biāo)準(zhǔn)品，圖3、圖4同。

圖3 23%分配比下標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的HPLC色譜圖Fig.3 The chromatogram of standard sample and vinegar sample in 23% distribution ratio

圖4 26%分配比下標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的HPLC色譜圖Fig.4 The chromatogram of standard sample and vinegar sample in 26% distribution ratio

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由檢測(cè)結(jié)果得出,川芎嗪在1.00～60.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性回歸方程為Y=11623X-19495(R2=0.990),阿魏酸在1.00～15.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性回歸方程為Y=49162 X+2192(R2=0.997),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度與峰面積之間的關(guān)系對(duì)樣品中川芎嗪和阿魏酸進(jìn)行定量。

2.5 檢出限和測(cè)定限

根據(jù)測(cè)定不同質(zhì)量濃度的川芎嗪和阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的檢測(cè)結(jié)果,得出川芎嗪和阿魏酸的檢出限分別為0.115、0.041μg/mL,測(cè)定限分別為0.383、0.135μg/mL。

2.6 精密度和穩(wěn)定性

精密度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1,川芎嗪相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.31%,阿魏酸相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.15%,方法精密度高[25-26]。

表1 川芎嗪和阿魏酸精密度Table1 Precision of Tetramethylpyrazine and Ferulic acid

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表2、表3得出,該方法在檢測(cè)川芎嗪時(shí)日內(nèi)精密度RSD值為1.84%,日間精密度RSD的2.46%,阿魏酸的日內(nèi)穩(wěn)定性RSD的值為1.57%,日間穩(wěn)定性RSD值為2.87%,穩(wěn)定性符合要求。

表2 川芎嗪和阿魏酸日內(nèi)穩(wěn)定性Table2 Results of inter-day stability testfor Tetramethylpyrazine and Ferulic acid

表3 川芎嗪和阿魏酸日間穩(wěn)定性Table3 Results of Intra-day stability testfor Tetramethylpyrazine and Ferulic acid

2.7 樣品測(cè)定和回收率

按上述處理方法和色譜條件對(duì)樣品(特級(jí)保寧醋)中川芎嗪和阿魏酸含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果得出,樣品中川芎嗪質(zhì)量濃度為51.52μg/mL,阿魏酸質(zhì)量濃度為11.54μg/mL,圖5為食醋樣品和對(duì)照品溶液的色譜圖,從圖5中可以看出川芎嗪的出峰時(shí)間為14.71min,阿魏酸的出峰時(shí)間為19.45min,由此可對(duì)阿魏酸和川芎嗪進(jìn)行定性。

圖5 食醋樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.5 The chromatogram of vinegar sample and standard sample 注:F-甲醇;G-川芎嗪和阿魏酸的混合標(biāo)準(zhǔn)品;H-食醋樣品;I-川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)品;J-阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品。

樣品的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示,其中川芎嗪的回收率為95.17%～106.08%,平均回收率達(dá)到100.01%,RSD為1.03%～3.01%,阿魏酸的回收率為96.25%～104.82%,平均回收率達(dá)到99.85%,RSD為0.93%～3.05%,回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果在誤差范圍內(nèi),表明樣品的前處理方法符合要求[11,25]。

3 結(jié)論

3.1 本文采用乙醇溶劑體系輔助超聲提取食醋樣品中的川芎嗪和阿魏酸,并堿化處理食醋樣品使雜質(zhì)形成鹽類,有效去除了雜質(zhì);因阿魏酸為酸性化合物,易電離,在流動(dòng)相中加入少量酸改善其峰形,且川芎嗪在酸性環(huán)境中的分離效果較好,故選擇甲醇和冰乙酸水溶液(0.2%冰乙酸)為流動(dòng)相,且甲醇∶水(0.2%冰乙酸)=23∶77(v/v)時(shí)目標(biāo)峰的峰型分離較好。

表4 不同加標(biāo)水平下的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table4 Results of recovery test for spiked samples

3.2 本文建立高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)食醋中川芎嗪和阿魏酸的方法,其檢測(cè)條件為:采用Sepax GP-C18柱,流動(dòng)相:甲醇∶水(0.2%冰乙酸)=23∶77(v/v),檢測(cè)波長(zhǎng)310nm,柱溫35℃,進(jìn)樣量10μL,1.0mL/min等梯度洗脫。由檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)結(jié)果得出川芎嗪在1.0～60.0μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為Y=11623X+19495(R2=0.990);阿魏酸在1.0～15.0μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為Y=49162X+2192(R2=0.997),且川芎嗪和阿魏酸的檢出限分別為0.115、0.041μg/mL,測(cè)定限分別為0.383、0.135μg/mL,日內(nèi)、日間穩(wěn)定性較好,表明檢測(cè)方法準(zhǔn)確、可行;對(duì)其進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果得出川芎嗪的平均回收率達(dá)到100.01%,阿魏酸的平均回收率99.85%,表明樣品的前處理方法符合要求。該方法操作簡(jiǎn)便快捷,重復(fù)性、穩(wěn)定性好,結(jié)果可靠準(zhǔn)確。本方法與LC/MS和GC/MS分析方法相比需要的儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、對(duì)操作人員要求不高,可作為食醋質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)的參考。

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Simultaneous determination of tetramethylpyrazine and ferulic acid in vinegar by HPLC

LI Jian-long1,LIU Shu-liang1,*,PENG Yang1,LIU Jun2,YANG Yong3,HAN Xin-feng1,HOU Xiao-yan1,XIA Xiao-long1,LUO Pei-wen1,JIA Qiu-si1

(1.College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China;2.Colledge of Biology Engineering Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China;3.Sichuan Baoning Vinegar Co.,Ltd.,Langzhong 645000,China)

This paper established a method for simultaneous determination of tetramethylpyrazine and ferulic acid in vinegar by HPLC. The analysis was performed on a Sepax GP-C18column with 35℃;the mobile phase was methanol-water(containing 0.2 % acetic acid)(23∶77,v/v);the detection wave length was 310nm;injection volume 10μL;the flow rate of gradient elution was 1.0mL/min. Results showed that good linearity was obtained over the range of 1.0 to 60.0μg/mL(R2=0.990)for tetramethylpyrazine and 1.0 to 15.0μg/mL(R2=0.997). The retention time of tetramethylpyrazine and Ferulic acid was 14.71 and 19.45min respectively,the average recovery was 100.01% and 99.85% respectively. This method was rapid,sensitive and the sample preparation was simple,so it could be applied to the determination of tetramethylpyrazine and ferulic acid in vinegar products.

HPLC;ferulic acid;tetramethylpyrazine;vinegar

2014-08-07

李建龍(1987-)，男，碩士研究生，研究方向：食品微生物。

*通訊作者:劉書亮(1968-)，男，博士，教授，主要從事食品微生物與發(fā)酵工程研究。

四川省科技廳科技支撐計(jì)劃(2013NZ0055)。

TS207.3

A

:1002-0306(2015)09-0287-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.054