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三聚氰胺對雄性小鼠精液質(zhì)量的影響*

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-03-19網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.0937.008.html

夏鳳瓊， 黃健， 楊國珍**

(貴州省骨科醫(yī)院 檢驗科， 貴州 貴陽550002)

[摘要]目的： 探討三聚氰胺對雄性小鼠精液質(zhì)量的影響。方法: 健康雄性昆明種小鼠50只，隨機(jī)分為陰性對照組(生理鹽水)、陽性對照組(環(huán)磷酰胺)和三聚氰胺低、中、高劑量組，分別予0.01 mL/g生理鹽水灌胃，40 mg/kg環(huán)磷酰胺腹腔注射，400 mg/kg(1/8LD50)、800 mg/kg (1/4LD50)、1 600 mg/kg (1/2LD50)三聚氰胺灌胃，于首次染毒后第35天處死小鼠，稱量睪丸及附睪，計算臟器系數(shù)；顯微鏡下計數(shù)精子數(shù)量、精子活動率、精子畸形率。結(jié)果: 三聚氰胺各劑量組小鼠睪丸、附睪臟器系數(shù)下降，其中，中、高劑量組睪丸臟器系數(shù)與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；高劑量組附睪臟器系數(shù)與陰性對照組比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高、中、低三聚氰胺組小鼠的精子數(shù)量及精子活動率呈下降趨勢，精子畸形率呈上升趨勢，與陰性對照組比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。結(jié)論: 三聚氰胺對雄性小鼠的生殖細(xì)胞可產(chǎn)生一定的毒性作用。

[關(guān)鍵詞]小鼠； 三聚氰胺； 臟器系數(shù)； 精子計數(shù)； 精液質(zhì)量

隨著全球工業(yè)化的快速發(fā)展，環(huán)境和食品污染對人體健康的影響日益突出，男性生育能力逐年下降，導(dǎo)致的不育比例大概占不孕不育總數(shù)的一半。過去50年間，男性精液質(zhì)量下降十分顯著。三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，俗稱三胺或者蛋白精，由于其含氮量高，再加上現(xiàn)有凱氏定氮法檢測蛋白質(zhì)含量的缺陷，許多不法分子便趁機(jī)將三聚氰胺添加于食品中來提高食品的含氮量[3-5]。王玉燕等研究指出三聚氰胺具有腎臟和肝臟毒性，可促進(jìn)雄性昆明鼠肺、腎、肝、脾細(xì)胞凋亡[6-8]。目前關(guān)于三聚氰胺對雄性小鼠生殖毒性方面的研究報道甚少。本研究以健康雄性昆明種小鼠為研究對象，用不同劑量的三聚氰胺通過灌胃對小鼠進(jìn)行染毒，觀察睪丸附睪及臟器系數(shù)、觀察精子數(shù)量及形態(tài)改變，初步探討三聚氰胺對雄性小鼠的生殖毒性。

1材料與方法

1.1　實驗動物

選擇6~8周齡健康雄性昆明種小鼠50只，體重25~30 g，購于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號SCXK(渝)2001-0005。

1.2　動物模型建立

將雄性小鼠隨機(jī)分為5組，陰性對照組(生理鹽水)、陽性對照組(環(huán)磷酰胺)和三聚氰胺低、中、高劑量組，每組10只。三聚氰胺低、中、高染毒劑量是參照三聚氰胺的LD50(中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)：食品安全性毒理學(xué)評價的程序和方法及化妝品衛(wèi)生規(guī)范)制定，分別為400 mg/kg(1/8LD50)、800 mg/kg (1/4LD50)、1 600 mg/kg (1/2LD50)，每天定時經(jīng)口灌胃1次，連續(xù)5 d，自由飲食飲水；陰性對照組0.01mL/g生理鹽水每天經(jīng)口灌胃1次，連續(xù)5 d；陽性對照組40 mg/kg環(huán)磷酰胺，每天腹腔注射1次，連續(xù)5 d，自由飲食飲水。于第1次染毒結(jié)束后第35天，頸椎脫臼處死小鼠，取睪丸和附睪。

1.3　小鼠睪丸、附睪臟器系數(shù)測定

脫臼處死小鼠后，分離睪丸、附睪，將周圍血管和周圍組織剝離干凈，吸干水分，稱重，計算臟器系數(shù)。睪丸臟器系數(shù)(%)=睪丸重量(g)÷小鼠體重(g)×100%，附睪臟器系數(shù)(%)=附睪重量(g)÷小鼠體重(g)×100%。

1.4　精液質(zhì)量分析

將完整分離的左側(cè)附睪置于盛有37 ℃預(yù)溫的1 mL 0.9%生理鹽水中剪成小塊，用吸管將懸浮液輕輕吹打混勻15~20次，于37 ℃水浴箱中靜置10 min，待精子自由流出。

1.4.1精子活動率22 ℃室溫下，取新鮮制備的的精子懸液10 μL鏡檢。連續(xù)計數(shù)200個精子中活動精子數(shù)，計算精子活動率，分級。整個操作和觀察在室溫下進(jìn)行，10 min內(nèi)結(jié)束。按照WHO推薦的方法，將精子活動分為四級:Ⅰ級具有快速，直線的前向運動，Ⅱ級慢速或遲鈍的直線或非直線前向運動，Ⅲ級具有不向前的運動，Ⅳ級不活動。精子活動度(%)=(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)精子數(shù)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)精子數(shù)×100%。

1.4.2精子計數(shù)將精子懸液置于60 ℃水浴箱中孵育10 min(殺死精子)，取10 μL于血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)池內(nèi)，按紅細(xì)胞計數(shù)法， 計數(shù)中央大方格內(nèi)5個中方格內(nèi)精子數(shù)，計算出每mL精液中的精子數(shù)。精子總數(shù)=5個中方格的精子總數(shù)×5×10×103。

1.4.3精子畸形率取制備好的精子濾液涂片，空氣中自然干燥后，用甲醛固定過夜，晾干，1.5%伊紅染色90 min，細(xì)流水輕輕沖洗，自然干燥。 每只小鼠檢查完整精子1 000個，計算出畸形精子的百分率。精子畸形可分為無鉤、胖頭、無定形、大頭、雙頭、香蕉頭、雙頭、雙尾等，輪廓不清、有頭無尾、與其他精子或碎片重疊以及明顯認(rèn)為剪碎的精子均不列入計算。精子畸形率(%)=畸形的精子數(shù)/檢查的精子數(shù)×100%。

1.5　統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1　小鼠睪丸、附睪臟器系數(shù)

隨著染毒劑量增加，三聚氰胺各劑量組睪丸及附睪臟器系數(shù)均降低，其中，中、高三聚氰胺劑量組睪丸臟器系數(shù)比陰性對照組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。高劑量組附睪臟器系數(shù)低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與陽性對照組相比，三聚氰胺中、高劑量組附睪臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組小鼠的睪丸、附睪臟器系數(shù)±s)

(1)與陽性對照組相比，P<0.05；(2)與陰性對照組相比，P<0.05

2.2　小鼠精液質(zhì)量

精子計數(shù)：與陰性對照組相比，三聚氰胺低、中、高劑量組精子數(shù)量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與陽性對照組相比，三聚氰胺高劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。精子活動率：與陰性對照組相比，三聚氰胺低、中、高劑量組精子活動率均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與陽性對照組相比，三聚氰胺低、中、高劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。精子畸形率：與陰性對照組相比，三聚氰胺低、中、高劑量組精子畸形率均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2和圖1。

表2　各組小鼠的精液質(zhì)量(n=10)

(1)與陰性對照組相比，P<0.05；(2)與陽性對照組相比，P<0.05

注： a為正常精子形態(tài)；b～i為異常形態(tài)精子，分別為卷曲、胖頭、小頭、香蕉頭、無定形、無鉤、雙尾和雙頭畸形圖1　小鼠精子形態(tài)(400×)Fig.1　Sperm morphology of mice

3討論

睪丸和附睪是精子生成的場所，因此睪丸和附睪臟器系數(shù)的變化在一定程度上可反映外來化學(xué)物質(zhì)對小鼠睪丸和附睪的損傷。同時臟器系數(shù)的變化可較好的反映化學(xué)毒物對該臟器的毒性綜合情況，也是尋找毒物作用靶器官的有效途徑。一般認(rèn)為，臟器系數(shù)增大，表示該臟器可能發(fā)生水腫、充血或者增生肥大；臟器系數(shù)減小，表示該器官可能有萎縮或者其他退行性改變[10]。本次實驗小鼠經(jīng)三聚氰胺染毒后，中、高劑量三聚氰胺小鼠的睪丸臟器系數(shù)明顯下降；高劑量三聚氰胺小鼠的附睪臟器系數(shù)明顯下降，表明三聚氰胺可能引起了小鼠睪丸和附睪的萎縮。精液質(zhì)量是評價雄性生育能力的重要指標(biāo)，其中精子數(shù)量、活動率以及畸形率是決定精液質(zhì)量的主要參數(shù)，可檢測環(huán)境因子對精子生成、發(fā)育的影響，對已知的生殖細(xì)胞致突變物有高度敏感性[9,11]。精子數(shù)量減少常常是各種化學(xué)物質(zhì)損傷各級生精細(xì)胞生長和發(fā)育的結(jié)果，精子活動率降低通常與精子能量代謝相關(guān)，精子形態(tài)檢查是評價男性生育力的一個重要指標(biāo)，與受孕有直接的關(guān)系[12]。精子數(shù)量減低、活動率下降及畸形率增高通常可降低精子的授精能力，從而導(dǎo)致男性不育。本次研究所用的陽性對照劑為環(huán)磷酰胺是目前常用的一種烷化劑類抗腫瘤藥物，臨床常用于各種惡性腫瘤的化療、自身免疫性疾病及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療[13]。并且已有報道證實，環(huán)磷酰胺可對男性生精功能造成損害[14]，本次研究中，環(huán)磷酰胺組與陰性對照組比較，睪丸、附睪臟器系數(shù)及精液質(zhì)量均下降，為本研究實驗方法及技術(shù)的可靠性提供了強(qiáng)有力的保障。本次研究結(jié)果顯示，三聚氰胺各劑量組精子數(shù)量及活動率均明顯降低，精子畸形率顯著增加，且呈劑量—反應(yīng)關(guān)系。有文獻(xiàn)報道三聚氰胺可破壞小鼠血睪屏障[15]。綜上所述，三聚氰胺對雄性小鼠的生殖細(xì)胞可產(chǎn)生一定的毒性作用，具有生殖遺傳毒性。

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(2014-12-12收稿，2015-01-23修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 周凌

Effects of Melamine on Semen Quality in Male Mice

XIA Fengqiong, HUANG Jian, YANG Guozhen

(DepartmentofClinicalLaboratory,OrthopedicHospitalofGuizhouProvince,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective:To study the effects of melamine on semen quality of male mice. Methods: Fifty male Kunming mice were randomly divided into saline negative control group, positive control group, low, medium, high doses of melamine groups with 10 mice in each group, and mice in each group were given 0.01 mL/g physiological saline, 40 mg/kg cyclophosphamide, 400, 800, 1 600 mg/kg melamine respectively. Thirty-five days after the first administration, mice were sacrificed. Organ coefficients of testes and epididymides were calculated, and the sperm number, sperm motility and sperm deformity were observed under optical microscope. Results: Organ coefficients of testes and epididymides in the three melamine groups were decreased, and there were statistical differences in organ coefficients of testes between middle, high doses of melamine groups and negative control group(P<0.01) and in organ coefficients of epididymides between high dose group and negative control group(P<0.05). Sperm number and motility decreased, and sperm deformity increased in the three melamine groups, compared with the negative control group, there were statistical difference(P<0.05 or P<0.01 ). Conclusions: Melamine has certain toxic effects on germ cells of male mice.

[Key words]mice; melamine; organ coefficient; sperm count; sperm quality

[中圖分類號]R698.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)03-0253-04

通信作者**E-mail:ygzandkj29@sina.com

[基金項目]*生殖工程中心項目經(jīng)費支助；貴州省科技廳項目[黔科合LH字(2014)7120]