歐陽(yáng)霞輝，徐紅偉，張德榮1，，令世鑫1，，馮若飛1，，李明生1，，喬自林1，，馬忠仁1，，柏家林1，*

(1.甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730030；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730030；3.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，甘肅蘭州730030)

綿羊脂聯(lián)素受體2基因生物信息學(xué)分析

歐陽(yáng)霞輝2，徐紅偉3，張德榮1，2，令世鑫1，2，馮若飛1，2，李明生1，2，喬自林1，2，馬忠仁1，2，柏家林1，2*

(1.甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730030；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730030；3.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，甘肅蘭州730030)

采用生物信息學(xué)方法對(duì)綿羊(蘭州大尾羊)AdipoR2基因及其所對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析.結(jié)果顯示，AdipoR2基因全長(zhǎng)1 809 bp，編碼386個(gè)氨基酸多肽蛋白.核苷酸和氨基酸的同源性與山羊最高，分別為99.1%和99%，非洲爪蟾最低，分別為68.2%和78.5%.蘭州大尾羊AdipoR2編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占23.06%，β-片狀占27.72%，無(wú)規(guī)則卷曲占49.22%.ADIPOR2蛋白為跨膜蛋白，N-端位于胞內(nèi)，C-端位于胞外，由7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域組成.分析表明，綿羊AdipoR2基因由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，核苷酸序列變異以轉(zhuǎn)換為主，轉(zhuǎn)換/顛換比值為2.072.不同物種間綿羊與山羊AdipoR2核苷酸序列間變異最小(0.9%).系統(tǒng)發(fā)育分析表明，綿羊與山羊也首先聚為一類，推測(cè)綿羊與山羊的分歧時(shí)間大約在0.225百萬(wàn)年前.這些結(jié)果為進(jìn)一步分析綿羊脂聯(lián)素受體2(AdipoR2)基因功能及其所介導(dǎo)的脂聯(lián)素功能奠定了理論基礎(chǔ).

脂聯(lián)素受體2 基因；生物信息學(xué)；蘭州大尾羊

脂聯(lián)素(Adiponectin)是脂肪細(xì)胞所分泌的若干細(xì)胞因子中含量最高、迄今為止所發(fā)現(xiàn)的惟一與肥胖呈負(fù)相關(guān)的細(xì)胞因子，脂聯(lián)素能夠抗糖尿病[1～8]和抗動(dòng)脈粥樣硬化[4～5].肥胖癥、胰島素抵抗患者和II型糖尿病人血液中脂聯(lián)素含量呈下降狀態(tài)[2].增加小鼠體內(nèi)脂聯(lián)素含量能降低血糖和改善胰島素抵抗[5～7].相反，脂聯(lián)素不足則表現(xiàn)出胰島素抵抗和糖尿病[8～9].脂聯(lián)素主要通過(guò)激活A(yù)MPK[6～7]和PPARα[1],[2],[8]，以增強(qiáng)脂肪酸氧化及葡萄糖吸收，從而起到胰島素增敏作用，而其作用發(fā)揮需要受體介導(dǎo).脂聯(lián)素受體有受體1(Adiponectin receptor 1，AdipoR1)和受體2(Adiponectin receptor 2，AdipoR2)兩種，AdipoR1在肌肉組織表達(dá)最高，而AdipoR2在肝臟組織表達(dá)最高[8].AdipoRs含有七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，但結(jié)構(gòu)和功能上完全不同于G蛋白偶聯(lián)受體[8].AdipoR1與球狀脂聯(lián)素結(jié)合、AdipoR2與全長(zhǎng)脂聯(lián)素結(jié)合，從而引起AMPK[6～7]增加和PPARα[8]激活以及脂肪酸氧化和葡萄糖吸收增加[10].目前，AdipoRs可作為研究抗糖尿病和抗動(dòng)脈粥樣硬化新藥的靶分子.動(dòng)物生產(chǎn)中脂聯(lián)素及其受體基因可能是控制畜禽脂肪性狀的主效基因或與控制該性狀的主效基因相連鎖，在動(dòng)物分子育種實(shí)踐中可作為一個(gè)新的分子標(biāo)記.目前，人、猴、豬、牛、雞、大鼠、小鼠、非洲爪蟾、斑馬魚(yú)等物種脂聯(lián)素及其受體基因已被克隆，部分物種基因已定位于特定染色體上，并對(duì)其功能進(jìn)行了研究[11]，綿羊AdipoRs基因克隆及其相關(guān)功能研究尚未見(jiàn)報(bào)道.Philip等研究表明脂聯(lián)素受體能激活PPARα、AMPK、p38 MAPK[12]；Takashi和Toshimasa通過(guò)microRNA表達(dá)或抑制AdipoRs證明, AdipoRs介導(dǎo)球形結(jié)構(gòu)脂聯(lián)素或全長(zhǎng)脂聯(lián)素以增加PPARα和AMPK活性，進(jìn)而在增加脂肪酸氧化和葡萄糖攝取中發(fā)揮作用[10]；在模擬轉(zhuǎn)染C2Cl2肌細(xì)胞中, AdipoRs能增強(qiáng)AMPK、乙酰輔酶A羧化酶 (ACC)[7]和p38促分裂原活化蛋白激酶 (p38MAPK) 的磷酸化[12]，而其他的蛋白激酶 (如MAPK)卻不會(huì)被磷酸化[8], 具體機(jī)制尚不清楚.Ding等 (2004)[13]克隆了豬脂聯(lián)素Adipo1和AdipoR2 1 128 bp和1 161 bp的全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA序列，表明豬脂聯(lián)素可能具有與人和其他哺乳動(dòng)物相似的生理功能.Dai等[14]克隆表達(dá)豬脂聯(lián)素及其兩受體基因并對(duì)其進(jìn)行染色體定位，得到基因圖譜，對(duì)以后研究這3個(gè)基因功能、基因與脂肪代謝、與疾病的關(guān)系都有非常重要意義.Ramachandran等[15]研究發(fā)現(xiàn), 雞禁食48 h后, 脂肪組織中AdipoR2表達(dá)量明顯增加, 而腦下垂體中的AdipoR2表達(dá)量卻顯著下降, 兩受體在肝臟和間腦中都沒(méi)有變化，脂聯(lián)素也伴隨著下降, 推測(cè)AdipoR2基因表達(dá)可能受血清中胰島素水平影響.Tabandeh等[16]研究了不同生長(zhǎng)發(fā)育階段脂聯(lián)素及其受體基因在奶牛卵巢細(xì)胞中的表達(dá).本研究擬通過(guò)對(duì)項(xiàng)目組克隆的蘭州大尾羊AdipoR2基因全長(zhǎng)cDNA的生物信息學(xué)分析，以期為進(jìn)一步研究其功能及其所介導(dǎo)的脂聯(lián)素的功能奠定理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

數(shù)據(jù)來(lái)源于GenBank：綿羊(KF921623)、山羊(JX573540)、牛(NM_001040499)、馬(NM_001163830)、恒河猴(NM_001266618)、人(NM_024551)、小鼠(NM_197985)、大鼠(NM_001037979)、豬(NM_001007192)、雞(NM_001007854)和非洲爪蟾(NM_001094102).

1.2 方法

利用DNAstar 5.02 (DNASTAR Inc.，1996)軟件對(duì)項(xiàng)目組克隆的蘭州大尾羊AdipoR2基因序列(KF921623)和GenBank中其他物種序列進(jìn)行對(duì)比分析、對(duì)位排列，計(jì)算序列間核苷酸差異百分比；采用MEGA5.1軟件統(tǒng)計(jì)序列間轉(zhuǎn)換/顛換(Ts/Tv)比值，鄰接法(Neighor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自舉分析(Boststrap test)通過(guò)1 000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)獲得.根據(jù)公式T=K/2r計(jì)算綿羊與其他物種間分歧時(shí)間，其中T、K、r分別表示分歧時(shí)間、序列差異百分比和堿基替換率[18].

利用 ExPASY中 ProtParam 程序預(yù)測(cè)AdipoR2基因編碼的氨基酸序列的理化性質(zhì) (http://us.expasy.org/tools/protparam.htmL)；運(yùn)用SignalP 4.0 預(yù)測(cè)信號(hào)肽區(qū)域(http://genome.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；運(yùn)用 TMHMM 工具對(duì)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(http://genome.cbs.dtu.dk/services /TMHMM /)；運(yùn)用Self optimized prediction method (SOPM, IBCP-CNRS) (http://searchlauncher.bcm.tmc. edu/seq-search/struc-predict.html)軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu).

2 結(jié)果和分析

2.1 綿羊AdipoR2基因核苷酸及氨基酸序列分析

綿羊AdipoR2基因全長(zhǎng)1 809 bp, ORF為1 161 bp，起始密碼子ATG位于205 nt～207 nt, 終止密碼子TGA位于1 363 nt～1 365 nt，編碼386個(gè)氨基酸.編碼區(qū)兩側(cè)翼分別具有5’-UTR 204 bp(1～204 nt)和3’-UTR 444 bp (1 366～1809 nt)，終止信號(hào)AATAAA出現(xiàn)在1 493～1 498 nt.

綿羊AdipoR2基因核苷酸序列與山羊、馬、牛、豬、恒河猴、人、小鼠、大鼠、雞和非洲爪蟾的同源性分別為99.1%、96.5%、87.7%、88.0%、86.3%、86.0%、84.1%、84.1%、75.9%、68.2%.將AdipoR2 核苷酸序列與綿羊基因組序列比對(duì)，可知AdipoR2基因位于綿羊第3號(hào)染色體，由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成(圖1).綿羊AdipoR2基因編碼386個(gè)氨基酸的多肽，分子量為43 622.5 Da，理論等電點(diǎn)為6.11，親水性指數(shù)為90.8，不穩(wěn)定指數(shù)為48.68，表明AdipoR2 為不穩(wěn)定蛋白.AdipoR2多肽中堿性氨基酸占7.5%，酸性氨基酸占14.1%，疏水性氨基酸占48.4%，極性氨基酸占29.4%.信號(hào)肽分析表明，AdipoR2蛋白無(wú)信號(hào)肽，屬膜結(jié)合蛋白.

SOPM預(yù)測(cè)蘭州綿羊AdipoR2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占23.06%，β-片狀占27.72%，無(wú)規(guī)則卷曲占49.22%.AdipoR2為跨膜蛋白，N-端位于膜內(nèi)，C-端位于膜外，由7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane domain, TD)組成，從N-端到C-端分別為TD1(147～168 AA)、TD2(182～204 AA)、TD3(216～239 AA)、TD4(246～267 AA)、TD5(277～299 AA)、TD6(308～329 AA)、TD7(348～367 AA)(圖2).綿羊AdipoR2蛋白質(zhì)氨基酸序列與山羊(predicted:Xp_005681099)、牛(NP_001035589)、馬(NP_001157302)、豬(NP_001007193)、人(NP_078827)、恒河猴(NP_001253547)、大鼠(NP_001033068)、小鼠(NP_0132102)、雞(NP_001007855)、非洲爪蟾(NP_001087571)的相似度分別為99%、97.2%、92%、91.2%、91.2%、90.9%、89.4%、88.6%、81.9%和78.5%.

2.2 綿羊AdipoR2基因序列變異分析

綿羊與其他物種間AdipoR2基因序列差異百分比見(jiàn)表1.綿羊與山羊間有較高的遺傳相似性，序列差異百分比在各物種間最小，為0.9%；恒河猴和人間的序列差異百分比為1.9%，遺傳相似性僅次于綿羊和山羊；小鼠與大鼠、綿羊與牛、山羊與牛之間序列差異百分比分別為3.1%、3.4%和3.6%，位于第三.作為外類群的兩棲類非洲爪蟾與各物種間序列差異百分比為31.0%～33.1%，平均為31.87%，序列差異百分比最大，表明遺傳相似性最小.

2.3 基于AdipoR2基因序列的綿羊系統(tǒng)發(fā)育分析

采用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3(圖中枝長(zhǎng)表示分歧度，節(jié)點(diǎn)的數(shù)值為1000次重復(fù)抽樣檢查的支持率).恒河猴和人首先聚為一支，節(jié)點(diǎn)的自舉支持率為100%，然后與馬聚為一類，節(jié)點(diǎn)的自舉支持率為75%以上.小鼠和大鼠聚為一支，節(jié)點(diǎn)的自舉支持率為100%；綿羊和山羊聚為一支，節(jié)點(diǎn)的自舉支持率為100%，然后與普通牛聚為一類，節(jié)點(diǎn)的自舉支持率也為100%.

本研究中各物種間AdipoR2核苷酸序列變異以轉(zhuǎn)換為主，轉(zhuǎn)換變異類型中以T/C轉(zhuǎn)換為主，占34.98%；A/G轉(zhuǎn)換占29.15%；在顛換變異類型中A/T、A/C、G/T、G/C顛換分別占8.73%、8.34%、9.60%和9.21%.綿羊及不同物種間AdipoR2基因的轉(zhuǎn)換/顛換比值為2.072，大于轉(zhuǎn)換/顛換比臨界值2.0，表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)換偏愛(ài)性.根據(jù)每百萬(wàn)年2%的分子進(jìn)化鐘推測(cè)蘭州大尾羊與山羊的分歧時(shí)間大約在0.225百萬(wàn)年前.

表1 基于綿羊脂聯(lián)素受體2基因的核苷酸序列變異率 (%)

3 討論

綿羊AdipoR2核苷酸序列相似性與山羊最高，為99.1%；與非洲爪蟾最低，為68.2%；與豬、牛、馬、恒河猴、人、小鼠、大鼠、雞介于96.5%～75.9%之間，表明AdipoR2核苷酸序列間具有較高的相似度.與山羊CDS核苷酸序列相比，在第87、162、807、828、876、1062位分別發(fā)生6次堿基轉(zhuǎn)換和第742、960、1155、1161位分別發(fā)生4次堿基顛換，以及2次堿基缺失和1次堿基插入.除山羊CDS外，本研究中所涉及10個(gè)物種AdipoR2 CDS均長(zhǎng)1 161 bp；山羊AdipoR2 CDS第1161位發(fā)生A→C堿基顛換，引起終止密碼突變，使終止密碼子TGA變成TGC，繼續(xù)指導(dǎo)合成肽鏈延伸至第二個(gè)終止密碼子GTA出現(xiàn)才結(jié)束，故山羊AdipoR2 CDS比其他物種長(zhǎng)15 bp，為1 176 bp.這一序列是2013年8月31日提交GenBank的成都麻羊AdipoR2序列(JX573540)，而2013年9月30日GenBank中另一由基因組測(cè)序推測(cè)的云南黑山羊AdipoR2序列中其CDS卻為1 161 bp (XM_005681042)，故山羊AdipoR2基因序列有必要進(jìn)一步研究.

綿羊AdipoR2基因由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，與小鼠AdipoR2基因結(jié)構(gòu)組成一樣[17].綿羊AdipoR2 CDS編碼386個(gè)氨基酸，其與山羊、牛、馬、豬、人、恒河猴的相似度分別為99%、97.2%、92%、、91.2、91.2%、90.9%；與大鼠、小鼠、雞、非洲爪蟾的相似度分別為89.4%、88.6%、81.9%、78.5%，表明AdipoR2蛋白氨基酸序列間具有較高保守性.預(yù)測(cè)的綿羊AdipoR2蛋白為跨膜蛋白，N-端位于膜內(nèi)，C-端位于膜外，由7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域組成，人和小鼠AdipoR2蛋白也有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[8，10，17].因此，與Yamauchi等(2003)[8]、Kadowaki和Yamauchi[10]、王會(huì)中等[17]研究結(jié)果一致，綿羊AdipoR2跨膜蛋白在結(jié)構(gòu)、功能上也不同于G蛋白偶聯(lián)受體.

AdipoR2核苷酸序列變異分析表明綿羊與山羊間有較高的遺傳相似性，序列差異百分比在各物種間最小，為0.9%.本研究中基于AdipoR2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)也獲得了相似結(jié)果，即綿羊和山羊間有較高遺傳相似性.本研究中各物種間AdipoR2核苷酸序列變異以轉(zhuǎn)換為主，轉(zhuǎn)換/顛換比值為2.072，大于轉(zhuǎn)換/顛換比臨界值2.0，表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)換偏愛(ài)性(bias)，說(shuō)明各物種間AdipoR2基因序列的突變未達(dá)到飽和狀態(tài)，選擇每百萬(wàn)年2%的分子進(jìn)化鐘[18].推測(cè)蘭州大尾羊與山羊的分歧時(shí)間大約在0.225百萬(wàn)年前.與郭軍等[19]對(duì)中國(guó)主要綿羊類群線粒體DNA研究結(jié)果中中國(guó)綿羊分化時(shí)間大約在0.21～0.32百萬(wàn)年前更新世大型食草動(dòng)物物種爆發(fā)期的結(jié)論相一致.

4 結(jié)論

運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析了1 809 bp綿羊全長(zhǎng)AdipoR2基因序列特征，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)和所編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、核苷酸序列變異和基于AdipoR2基因的綿羊系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步研究脂聯(lián)素受體功能及其所介導(dǎo)的脂聯(lián)素作用及其應(yīng)用提供了基礎(chǔ)材料.

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Bioinformatics of adiponectin receptor 2 gene in sheep, Ovis aries

OUYANG Xia-hui2, XU Hong-wei3, ZHANG De-rong1,2, LIN Shi-xin1,2，F(xiàn)ENG Ruo-fei1,2，LI ming-sheng1,2, QIAO Zi-lin1,2, MA Zhong-ren1，2，BAI Jia-lin1，2

(1.Gansu Engineering Research Center，Lanzhou 730030,China；2.College of Life Science and Engineering, Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030;3.Experimental Center, Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030,China)

We analyzed the gene structure of adiponectin receptor 2 (AdipoR2) of Lanzhou fat-tailed sheep and its encoded protein characteristics using bioinformatics method. The full length cDNA of AdipoR2 is 1 809 bp and its open reading frame is 1 161 bp in length, encoding a mature protein of 386 amino acids and resulting Mr=43 622.5. The sheep nucleotide sequence shares maximum (99.1%) and minimum (68.2%) homology with goat and African clawed frog, and 99% and 78.5% similarity with goat and frog proteins at the amino acid level. Predicted secondary structure of AdipoR2 contains 23.06% alpha helix, 27.72% extended strand and 49.22% random coil. AdipoR2 protein appears to be integral membrane protein; the N terminus was internal, and the C terminus was external, which is predicted to contain seven transmembrane domains, but are structurally, topologically and functionally distinct from G protein coupled receptors. The genomic DNA of AdipoR2 includes seven exons and six introns. The nucleotide divergence percent of AdipoR2 between sheep and goat was minimum. Meanwhile, sheep and goat was also initially clustered in one group. Maximum composite likelihood estimate of the pattern of nucleotide substitution showed that transition/transversion (Ts/Tv) rate of AdipoR2 among different species was 2.072, higher than the critical value 2.0 and showed higher transition bias, speculating divergence time between sheep and goat was 0.225 MYA. These findings would be the basis of further study the function of AdipoR2 in sheep.

Adiponectin receptor 2 (AdipoR2) gene; bioinformatics; Lanzhou fat-tailed sheep

2015-11-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260533)；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1208RJZA188)；甘肅省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(1204FKCA182).

*

歐陽(yáng)霞輝(1978—)，女，甘肅靖遠(yuǎn)人，副教授,博士，主要從事動(dòng)物生殖與發(fā)育方面的研究.

S826

A

1009-2102(2015)04-0045-06