魏 佳綜述，李惠民審校

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科 650032）

急性髓系白血病（AML）并非是一種單一的疾病，而是一組具有不同形態(tài)學(xué)、免疫表型、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)特征的異質(zhì)性、克隆性造血干／祖細(xì)胞疾病。通過(guò)化療能使大部分AML患者緩解，完全緩解（CR）率達(dá)50%～80%[1]，但仍有約65%的患者最終在3～5年內(nèi)復(fù)發(fā)，提示目前的治療方案尚不能完全清除體內(nèi)的病變細(xì)胞，而這些殘留的白血病細(xì)胞，即微小殘留病灶（MRD），是最終復(fù)發(fā)的根源[2-3]。目前用于MRD的檢測(cè)方法有經(jīng)典的細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR、RQ-PCR）、多參數(shù)流式細(xì)胞儀（MFC）和熒光原位雜交（FISH）。MFC、PCR是臨床上最常用的檢測(cè)手段，二者的出現(xiàn)打破了單純依靠細(xì)胞形態(tài)學(xué)來(lái)定義CR的局限性。MFC可在短時(shí)間內(nèi)分析大量白血病細(xì)胞檢測(cè)MRD，能夠提供獨(dú)立預(yù)后信息和及時(shí)、可靠的臨床一手資料，指導(dǎo)制訂個(gè)體化的治療方案，達(dá)到降低復(fù)發(fā)率和延長(zhǎng)生存期的目的。

1 白血病細(xì)胞的免疫表型特點(diǎn)

白血病相關(guān)免疫表型（LAIPs）在正常骨髓或外周血細(xì)胞上不表達(dá)或低表達(dá)，而在白血病細(xì)胞上表達(dá)或高表達(dá)。AML中的LAIPs具有以下特點(diǎn)：（1）抗原跨系表達(dá)（如CD2、CD4、CD5、C7、C10、C19、C56）；（2）抗原跨階段表達(dá)（如CD34＋／CD11＋，CD34＋／CD15＋）；（3）抗原的過(guò)度表達(dá)、低表達(dá)或缺失（如CD34、CD13、CD38、CD33和HLA-DR等抗體的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)或減弱）；（4）光散射異常（CD13＋光散射異常）[4]。這些抗原異常表達(dá)的特點(diǎn)成為識(shí)別白血病細(xì)胞，檢測(cè)MRD的基礎(chǔ)。

2 MFC檢測(cè)MRD的適用范圍與優(yōu)勢(shì)

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）雖然特異性和敏感性高，但AML中存在合適的目標(biāo)分子（如：PML-RARa、AML-ETO、CBFβ-MHY11等）加上FLT3、NPM1等基因突變的患者僅占60%～70%[5]，因此運(yùn)用局限。并且白血病細(xì)胞在克隆演變的過(guò)程中可能發(fā)生靶基因長(zhǎng)度和位點(diǎn)的變化，甚至出現(xiàn)新的突變基因，將導(dǎo)致PCR法檢測(cè)的漏診和監(jiān)測(cè)的中斷，意味著將有更多的患者無(wú)法用PCR對(duì)MRD實(shí)行有效的監(jiān)測(cè)。

MFC可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，是AML患者檢測(cè)MRD的有效方法[6]。美國(guó)St Jude兒童醫(yī)院AML02研究中檢測(cè)到95%的AML患者存在LAIPs，MFC適用于幾乎所有AML患者[7]。運(yùn)用MFC的檢測(cè)方法不僅能準(zhǔn)確定量殘留白血病細(xì)胞數(shù)，還可以進(jìn)一步分析殘留白血病細(xì)胞的增殖、凋亡及耐藥等生物學(xué)特性，反映白血病細(xì)胞對(duì)化療的敏感性、自身生物學(xué)特性及體內(nèi)腫瘤負(fù)荷情況。此外，MFC可以在同一次檢測(cè)中追蹤多個(gè)異常的免疫表型，在MRD檢測(cè)時(shí)只需要一種異常分子標(biāo)志即可被檢出，不會(huì)像基因突變那樣影響檢測(cè)效能。但AML細(xì)胞在復(fù)發(fā)時(shí)出現(xiàn)“抗原漂移”的頻率高，因此目前建議診斷時(shí)至少需要記錄2個(gè)異常免疫表型用于以后的MRD檢測(cè)。初診時(shí)全面而完整的免疫表型分析、個(gè)體化設(shè)計(jì)表型組合、多個(gè)白血病相關(guān)標(biāo)志聯(lián)合等策略均能增加MFC檢測(cè)結(jié)果的可信度。

3 MFC檢測(cè)MRD的敏感性

影響檢測(cè)的靈敏度、特異性的因素有：（1）惡性細(xì)胞缺乏抗原特異性；（2）一些小克隆的亞群存在并且很難識(shí)別；（3）表型轉(zhuǎn)換無(wú)法識(shí)別；（4）缺乏有經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)技術(shù)的工作人員。當(dāng)靈敏度達(dá)10-5～10-4，標(biāo)本需要的有核細(xì)胞數(shù)約500 000個(gè)，保證樣本質(zhì)量是保證靈敏度的前提。MD安德森癌癥中心[4]采用的是8色的流式細(xì)胞儀，檢測(cè)時(shí)標(biāo)本有核細(xì)胞數(shù)量大于200 000個(gè)以保證靈敏度至少為10-4，先檢測(cè)大量正常骨髓標(biāo)本建立一個(gè)評(píng)估的基線，以此為參照，根據(jù)CD13、CD34、CD38、CD45、CD117、HLA-DR等抗體的熒光強(qiáng)弱分析是否是LAIPs。Al-Mawali等[8]是在CD45／CD34／CD117的基礎(chǔ)上添加不同的淋巴系或髓系抗原以提高檢出LAIPs的靈敏度。隨著8色、10色流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的面市，MRD檢測(cè)的靈敏度和可靠性得到了更大的提高。

4 MRD檢測(cè)的時(shí)機(jī)和陽(yáng)性閾值

MRD的結(jié)果不僅應(yīng)與檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)和治療方法相聯(lián)系，還應(yīng)考慮患者的個(gè)體因素和疾病特征。目前認(rèn)為影響預(yù)后重要的時(shí)間點(diǎn)是誘導(dǎo)治療后、鞏固治療后、維持治療后及移植前后。不過(guò)，有的研究認(rèn)為持續(xù)動(dòng)態(tài)進(jìn)行MRD監(jiān)測(cè)更有意義，對(duì)于某個(gè)確定時(shí)間點(diǎn)的MRD，并不能完全反映治療效果[4]。

定義MRD的閾值主要是為了早期發(fā)現(xiàn)高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)患者，據(jù)此調(diào)整治療策略。Feller等[9]通過(guò)多中心的研究推薦MRD的閾值為0.01%，目前國(guó)內(nèi)大多學(xué)者對(duì)此也比較認(rèn)同[10]。對(duì)高M(jìn)RD（CR后任何時(shí)間點(diǎn)MRD水平大于10-4）患者建議進(jìn)行強(qiáng)化的緩解后治療或針對(duì)MRD的靶向治療，對(duì)低MRD（CR后所有時(shí)間點(diǎn)MRD水平小于10-4）或MRD陰性患者，建議降低治療強(qiáng)度或縮短治療時(shí)間，以達(dá)到人性化、個(gè)體化、規(guī)范化的治療策略。

最近國(guó)外也有研究將0.15%作為判斷預(yù)后的閾值，據(jù)此將患者劃分為復(fù)發(fā)組和長(zhǎng)期生存組，但實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示仍有44%MRD陰性的患者最后復(fù)發(fā)。相較而言，另有學(xué)者認(rèn)為任何數(shù)量的MRD存在均與預(yù)后相關(guān)，很可能不同的時(shí)間點(diǎn)、不同的患者有不同的閾值，這些都由患者本身的分子生物學(xué)特性所決定。MRD閾值水平不同，所得到的研究結(jié)論亦很難進(jìn)行統(tǒng)一的評(píng)價(jià)，這個(gè)缺陷將是MFC檢測(cè)MRD在臨床運(yùn)用中所面臨的一個(gè)重要挑戰(zhàn)[11]。

5 MFC在AML中的運(yùn)用

在AML患者中，Al-Mawali等[8]運(yùn)用5色MFC發(fā)現(xiàn)：非同步表達(dá)往往在相對(duì)成熟骨髓細(xì)胞中易見（如早期的抗原表型CD34、CD117和相對(duì)成熟的標(biāo)志CD15、CD65共表達(dá)），而跨系表達(dá)在原始髓細(xì)胞中是最常見的LAIPs類型（表達(dá)淋巴系標(biāo)志CD2、CD4、CD5、C7、C10、C19）。

5.1 化療后的監(jiān)測(cè) 運(yùn)用MFC檢測(cè)AML患者的MRD，最有效的方法就是在診斷時(shí)識(shí)別1個(gè)或多個(gè)LAIPs，為后續(xù)治療建立一個(gè)完善的評(píng)價(jià)體系。Kern等[12]對(duì)58例誘導(dǎo)治療和62例鞏固治療的AML患者進(jìn)行了研究，這些患者中LAIPs包括：抗原不同步表達(dá)、抗原跨系表達(dá)、抗原缺失、抗原過(guò)表達(dá)。每例患者至少追蹤1個(gè)LAIPs，從診斷到治療達(dá)CR，LAIPs陽(yáng)性細(xì)胞減少的程度用LD值表示。在鞏固治療組LD值與總生存率（OS）、無(wú)復(fù)發(fā)生存期（RFS）均相關(guān)（P＝0.005）；在誘導(dǎo)治療組LD值只與RFS相關(guān)，與OS無(wú)關(guān)（P＝0.0001）；LD值越大，2年的總生存率（OS）、5年的無(wú)病生存（EFS）越高，另外，LD值可作為細(xì)胞遺傳學(xué)的協(xié)變量，并認(rèn)為3個(gè)療程鞏固治療后的MRD水平預(yù)后價(jià)值更大。無(wú)論是在兒童或是成人，MFC監(jiān)測(cè)的MRD與復(fù)發(fā)密切相關(guān)，并且認(rèn)為MFC更靈敏、可靠。Loken等[13]發(fā)現(xiàn)，27例AML患者中有7例沒(méi)有達(dá)到細(xì)胞形態(tài)學(xué)的緩解，這7例患者M(jìn)FC檢測(cè)的MRD是陰性的，卻相比剩下的20例患者獲得更長(zhǎng)的生存期。Inaba等[14]發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)治療后大于或等于0.1%MRD復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高，預(yù)后差，相較于細(xì)胞形態(tài)學(xué)，MFC檢測(cè)MRD預(yù)后的意義更大。

5.2 異基因造血干細(xì)胞移植前后的監(jiān)測(cè) 異基因造血干細(xì)胞移植已經(jīng)成為中危、高危患者治療的重要手段，Bastos-Oreiro等[15]檢測(cè)了29例AML患者在異基因造血干細(xì)胞移植前后MRD的情況，其中18例移植后MRD陰性（LAIPs≤0.1%）比MRD陽(yáng)性（LAIPs≥0.1%）復(fù)發(fā)率低（15%vs.66%，P＝0.045）、1年的OS高（83%vs.52%，P＝0.021）。12例移植后MRD陽(yáng)性的患者，采取了移植后的干預(yù)治療（逐漸減少免疫抑制、供體淋巴細(xì)胞輸注或二次移植），其中有5例MRD消失，疾病得到了控制，其他7例患者復(fù)發(fā)。Walter等[16]對(duì)99例CR1后行異基因造血干細(xì)胞移植的AML患者進(jìn)行研究，運(yùn)用10色流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)移植前MRD陽(yáng)性與高復(fù)發(fā)率相關(guān)，并能縮短DFS、OS。Anthias等[17]認(rèn)為移植前的MRD與疾病復(fù)發(fā)、誘導(dǎo)治療失敗相關(guān)，對(duì)于MRD陽(yáng)性（＞0.1%）的患者，應(yīng)調(diào)整相應(yīng)的移植策略，例如早期增加GVL效應(yīng)或移植后預(yù)防性的給予供者淋巴細(xì)胞輸注；而對(duì)于MRD陰性的患者則可以適當(dāng)降低治療強(qiáng)度。Diez-Campelo等[18]認(rèn)為在移植后100 d監(jiān)測(cè)MRD意義較大，MRD大于或小于0.1%區(qū)分患者的不同風(fēng)險(xiǎn)度。

6 結(jié)語(yǔ)

2014年NCCN臨床實(shí)踐指南中提出目前尚無(wú)推薦的檢測(cè)MRD的方法。但根據(jù)臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，MFC和PCR是AML中定量檢測(cè)MRD最可靠、有效的兩種方法，但各有利弊。PCR應(yīng)用范圍窄，檢測(cè)的靶基因清除慢，不適合早期時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)，多用于鞏固和維持治療后。MFC適用于所有AML亞型的患者，可在早期發(fā)現(xiàn)高?；颊?，及時(shí)調(diào)整治療方案，但未來(lái)需要明確在什么時(shí)間點(diǎn)選用什么方法最有效，如何將MRD定量檢測(cè)的過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化，建立統(tǒng)一的閾值水平，需要實(shí)驗(yàn)室與實(shí)驗(yàn)室間、實(shí)驗(yàn)室和臨床醫(yī)生間加強(qiáng)合作，共同突破這些局限。MRD檢測(cè)結(jié)果不僅應(yīng)與檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)相聯(lián)系，還應(yīng)與患者的年齡、疾病分層、治療方法相聯(lián)系，選擇有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室也十分重要，只有綜合分析多種影響因素，才能更客觀地評(píng)價(jià)疾病狀態(tài)，有效地指導(dǎo)制訂患者的治療方案。

最近有研究者使用MFC分析白血病干細(xì)胞（Leukemic stem cells，LSCs），LSCs通過(guò)自我更新和無(wú)限增殖模模擬正常造血作用，產(chǎn)出白血病細(xì)胞，化療雖然能有效殺死白血病細(xì)胞，但卻不能完全清除白血病干細(xì)胞，這些細(xì)胞可能導(dǎo)致MRD的持續(xù)存在，最終導(dǎo)致復(fù)發(fā)。與造血干細(xì)胞類似，LSCs表達(dá)CD34＋／CD38-[19]，體外成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD123，CD44，CD47可以用以區(qū)分LSCs[20]。因此MFC可以用來(lái)識(shí)別這些潛在的MRD來(lái)源，幫助發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點(diǎn)來(lái)消除它。

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