池 青， 周 鵬，劉香利,，程繪繪，趙惠賢,

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 生命科學(xué)學(xué)院，b 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)PYL5基因小麥的獲得與鑒定

池 青a， 周 鵬b，劉香利a,b，程繪繪a，趙惠賢a,b

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 生命科學(xué)學(xué)院，b 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

【目的】 通過基因槍介導(dǎo)共轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)擬南芥抗旱基因PYL5的小麥植株，為轉(zhuǎn)基因小麥的抗旱功能研究奠定基礎(chǔ)。【方法】 以小麥品種西農(nóng)889、綿陽(yáng)19和寧春16為供試材料，通過基因槍介導(dǎo)法將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Rd29A啟動(dòng)的PYL5基因和篩選標(biāo)記基因Bar共轉(zhuǎn)化到小麥幼胚愈傷組織中，經(jīng)過除草劑PPT(Phosphinothricin)篩選和愈傷組織分化，獲得再生植株。根據(jù)目標(biāo)基因PYL5和Bar基因序列分別設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)移栽成活的小麥T0代再生植株進(jìn)行基因特異性PCR檢測(cè)?！窘Y(jié)果】 采用基因槍分別轟擊西農(nóng)889的1800個(gè)、綿陽(yáng)19的800個(gè)和寧春16的800個(gè)幼胚愈傷組織，經(jīng)過篩選和分化分別獲得了9，5和14株小麥再生植株；對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥T0代再生植株的基因特異性PCR檢測(cè)結(jié)果表明，西農(nóng)889、綿陽(yáng)19和寧春16Bar基因的轉(zhuǎn)化率分別為0.280%，0.500%和0.750%，PYL5基因的轉(zhuǎn)化率分別為0.110%，0.125%和0.500%，Bar和PYL5基因的共轉(zhuǎn)化率分別為0.110%，0.125%和0.500%。【結(jié)論】PYL5基因成功轉(zhuǎn)入到了小麥品種西農(nóng)889、綿陽(yáng)19和寧春16中。

小麥；基因槍法；共轉(zhuǎn)化法；PYL5基因

小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一。目前，世界上小麥播種面積的70%分布于干旱和半干旱地區(qū)[1]。在各種非生物脅迫中，干旱已經(jīng)成為限制小麥產(chǎn)量的主要因素之一[2]。因此，培育抗旱小麥品種是提高小麥總產(chǎn)量和緩解世界糧食安全問題的重要途徑。

迄今為止，我國(guó)小麥育種者通過傳統(tǒng)育種方法已經(jīng)培育出一大批抗旱小麥品種，為提高我國(guó)小麥產(chǎn)量做出了重要貢獻(xiàn)。但是傳統(tǒng)的遺傳改良方法育種周期較長(zhǎng)，而且很難使小麥抗旱性有很大程度的提高。近年來，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，利用基因工程方法定向改良小麥的性狀已經(jīng)成為傳統(tǒng)育種方法的有效補(bǔ)充。目前，利用植物基因工程改良方法已經(jīng)成功獲得了抗病[3-5]、抗蟲[6-7]、抗逆[8]、品質(zhì)改良[9-10]、高產(chǎn)量[11-12]等小麥轉(zhuǎn)基因品種或品系。通過將一些具有抗旱功能的基因轉(zhuǎn)入到植物體內(nèi)，可使轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性有一定程度的提高。Pellegrineschi等[13]采用基因槍介導(dǎo)法，將擬南芥的DREB1A基因?qū)肫胀ㄐ←溒贩NBobwhite 26中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性有了明顯的提高。Hmida-Sayari等[14]從擬南芥中克隆出了Δ′-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入到馬鈴薯中，發(fā)現(xiàn)在高鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于對(duì)照，且轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的脯氨酸含量有明顯的積累。He等[15]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將大腸桿菌膽堿脫氫酶基因(betA)轉(zhuǎn)到小麥品種濟(jì)南17號(hào)中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性均升高，而丙二醛含量降低，植株根長(zhǎng)和生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于對(duì)照。

脫落酸(ABA)是植物體內(nèi)最重要的5大生長(zhǎng)激素之一，有促進(jìn)氣孔關(guān)閉、水分吸收及降低葉片伸展率、調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞離子通道等重要的生理功能，對(duì)于保護(hù)植物在逆境中的生長(zhǎng)具有至關(guān)重要的作用[16-17]。PYL5基因是從擬南芥中克隆出來的編碼PYL蛋白的基因，PYL蛋白是ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的ABA受體蛋白，它通過與ABA的結(jié)合來抑制2C類絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)的活性，使ABA信號(hào)途徑向下傳遞，進(jìn)而提高植物的抗旱性[18-20]。擬南芥Rd29A啟動(dòng)子是逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子含有2個(gè)干旱、低溫和高鹽響應(yīng)順式作用元件，可被干旱、高鹽、低溫誘導(dǎo)表達(dá)，在逆境脅迫的早期，這些順式作用元件被誘導(dǎo)表達(dá)，從而激活靶基因的表達(dá)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性[21]。目前, 尚無關(guān)于利用PYL5基因進(jìn)行小麥遺傳轉(zhuǎn)化及提高小麥抗旱性的研究報(bào)道。

本研究構(gòu)建了由Rd29A驅(qū)動(dòng)的PYL5植物表達(dá)載體；采用基因槍共轉(zhuǎn)化方法，將目標(biāo)基因PYL5和篩選標(biāo)記基因Bar轉(zhuǎn)入弱冬性小麥品種西農(nóng)889、春小麥品種綿陽(yáng)19和寧春16的幼胚愈傷組織中，通過除草劑PPT(Phosphinothricin)篩選和愈傷組織的分化，獲得了含有目的基因PYL5的轉(zhuǎn)基因小麥植株，以期為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)PYL5基因小麥的遺傳穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)基因小麥的抗旱性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與載體質(zhì)粒

選用小麥品種西農(nóng)889、綿陽(yáng)19和寧春16為材料，于2011-2013年小麥生長(zhǎng)季節(jié)將其種植在西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥試驗(yàn)田，正常管理。共轉(zhuǎn)化所用載體質(zhì)粒分別為含有目標(biāo)基因PYL5的載體質(zhì)粒pRd29A::PYL5和含有篩選標(biāo)記基因Bar的載體質(zhì)粒pUBI::Bar。pRd29A::PYL5和pUBI::Bar的結(jié)構(gòu)見圖1。

1.2 小麥遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株的獲得

采集西農(nóng)889、綿陽(yáng)19和寧春16開花10 d后的未成熟種子，利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%升汞和體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒后，剝?nèi)∮着卟⑵涠芷辖臃N于MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+500 mg/L 酸水解酪蛋白+2.0 mg/L 2,4-D)上，25 ℃暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入高滲培養(yǎng)基(MS+0.4 mol/L 甘露醇+500 mg/L 酸水解酪蛋白+2.0 mg/L 2,4-D)，25 ℃暗培養(yǎng)6 h，然后采用Bio-Rad公司生產(chǎn)的PDS-1000/He型基因槍進(jìn)行轟擊(金粉用量為120 μg/槍，含篩選基因Bar和目標(biāo)基因PYL5，這2種質(zhì)粒濃度比為1∶1，用量均為1.0 μg/槍，轟擊壓力為1 100 psi，真空度為27～28 Pa，轟擊距離為9 cm)。將轟擊后的愈傷組織置于高滲培養(yǎng)基上25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)16 h，再轉(zhuǎn)移到MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)2周。將恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移至MS+PPT的分化篩選培養(yǎng)基(西農(nóng)889：MS +500 mg/L 酸水解酪蛋白+4.0 mg/L KT+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+ 4.0 mg/L PPT+30 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂；綿陽(yáng)19：MS +500 mg/L 酸水解酪蛋白+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L IAA+5.0 mg/L PPT+30 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂；寧春16:MS+500 mg/L 酸水解酪蛋白+4.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L PPT+30 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂)上，在溫度為25 ℃、照度為5 000 lx的光照條件下培養(yǎng)，每2周更換1次培養(yǎng)基，將分化出的小苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(1/2 MS+0.2 mg/L NAA)中，待苗高為4～5 cm時(shí)移至春化間(4 ℃)春化20～40 d，至小苗株高為7～8 cm時(shí)將根系發(fā)達(dá)的分化苗移栽到培養(yǎng)缽(直徑30 cm、高度50 cm)中，于溫室內(nèi)生長(zhǎng)。

1.3 轉(zhuǎn)基因小麥T0代植株的基因特異性PCR(AS-PCR)檢測(cè)

取轉(zhuǎn)基因植株幼嫩葉片，采用CTAB法[22]提取基因組DNA，根據(jù)Rd29A+PYL5基因序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物為：5′-GCAACT-CCAACACGGCTCAG-3′，下游引物為：5′-CATCAACGATGTAAGACTCCACCA-3′；預(yù)期擴(kuò)增片段大小為500 bp左右。Bar基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)的上游引物為：5′-TGCACCATCGTCAACCACTACAT-3′,下游引物為：5′-GCTGCCAGAAACCCACGTCAT-3′,預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為433 bp。PCR擴(kuò)增體系總體積為20 μL：10×PCR buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，上、下游引物(稀釋成10 μmol/L)各0.5 μL，TaqDNA聚合酶 0.2 μL (TianGen公司)，模板DNA約200 ng，補(bǔ)ddH2O至20 μL。Rd29A+PYL5的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。Bar的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。以非轉(zhuǎn)基因植株為陰性對(duì)照，ddH2O為空白對(duì)照，將擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因小麥植株的獲得

用含目標(biāo)基因PYL5與篩選標(biāo)記基因Bar的表達(dá)載體對(duì)西農(nóng)889(1 800塊幼胚愈傷組織)、綿陽(yáng)19(800塊幼胚愈傷組織)和寧春16(800塊幼胚愈傷組織)分別進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。3個(gè)品種部分愈傷組織的誘導(dǎo)和篩選分化結(jié)果如圖2所示，愈傷組織轉(zhuǎn)化和再生植株統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。對(duì)基因槍轟擊后的西農(nóng)889、綿陽(yáng)19和寧春16愈傷組織經(jīng)過恢復(fù)培養(yǎng)和篩選分化，分別獲得9，5和14株小麥再生植株(表1)。

2.2 轉(zhuǎn)基因小麥T0代再生植株的AS-PCR鑒定

將經(jīng)過PPT篩選的轉(zhuǎn)基因小麥再生植株移栽到溫室培養(yǎng)，取嫩葉提取基因組DNA進(jìn)行AS-PCR檢測(cè)。經(jīng)過多次AS-PCR檢測(cè)，非轉(zhuǎn)基因植株(陰性對(duì)照)和ddH2O(空白對(duì)照)中均沒有擴(kuò)增產(chǎn)物。西農(nóng)889轉(zhuǎn)化得到的9株再生植株中有5株(A4～A8再生植株)擴(kuò)增到與陽(yáng)性質(zhì)粒pUBI::Bar長(zhǎng)度一致的433 bp的目標(biāo)片段(圖3-A左)，表明這5株為轉(zhuǎn)Bar基因的陽(yáng)性植株，Bar基因轉(zhuǎn)化率為0.280%(5/1 800)；此外，這9株再生植株中有2株(A4和A6)擴(kuò)增到與陽(yáng)性質(zhì)粒pRd29A::PYL5長(zhǎng)度一致的500 bp左右的目標(biāo)片段基因(圖3-A右)，表明這2株為轉(zhuǎn)PYL5基因的陽(yáng)性植株，PYL5的轉(zhuǎn)化率為 0.110%(2/1 800)。因本試驗(yàn)采用Bar基因抗性進(jìn)行篩選，得到的轉(zhuǎn)目標(biāo)基因的陽(yáng)性植株均為Bar基因陽(yáng)性植株，即共轉(zhuǎn)化率與目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化率一致。由圖3-A可知，A4和A6再生植株同時(shí)轉(zhuǎn)入了PYL5和Bar基因，共轉(zhuǎn)化率為 0.110%。

將經(jīng)過PPT篩選的5株綿陽(yáng)19再生植株移栽到溫室，取樣進(jìn)行AS-PCR檢測(cè)。有4株(B4～B7再生植株)擴(kuò)增到與陽(yáng)性質(zhì)粒pUBI::Bar長(zhǎng)度一致的433 bp的目標(biāo)片段(圖3-B左)，Bar基因轉(zhuǎn)化率為0.500%(4/800)；5株再生植株中有1株(B4再生植株)擴(kuò)增到與陽(yáng)性質(zhì)粒pRd29A::PYL5長(zhǎng)度一致的500 bp左右的目標(biāo)基因片段(圖3-B右)，PYL5轉(zhuǎn)化率為0.125%(1/800)。 由圖3-B可知，B4再生植株同時(shí)轉(zhuǎn)入了PYL5和Bar基因，共轉(zhuǎn)化率為0.125%。

經(jīng)過PPT篩選，寧春16共得到14株再生植株，取樣進(jìn)行AS-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有6株(C4～C9再生植株)擴(kuò)增到與陽(yáng)性質(zhì)粒pUBI::Bar長(zhǎng)度一致的433 bp的目標(biāo)片段(圖3-C左)，表明這6株為轉(zhuǎn)Bar基因的陽(yáng)性植株，Bar基因轉(zhuǎn)化率為0.750%(6/800)；14株再生植株中有4株(C4、C5、C8和C9再生植株)檢測(cè)到與陽(yáng)性質(zhì)粒pRd29A::PYL5長(zhǎng)度一致的500 bp左右的擴(kuò)增片段(圖3-C右)，表明這4株為轉(zhuǎn)PYL5基因的陽(yáng)性植株，PYL5轉(zhuǎn)化率為0.500%(4/800)。 由圖3-C可知，C4、C5、C8和C9再生植株同時(shí)轉(zhuǎn)入了PYL5基因和Bar基因，共轉(zhuǎn)化率為0.500%。

3 討 論

根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可以將其分成3類：組織特異性啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[23]。在植物基因工程改良研究的初期，多采用組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因的高效和非特異性表達(dá)，但是這種表達(dá)模式不僅會(huì)造成植物體內(nèi)能量的過度消耗，還有可能造成基因沉默現(xiàn)象[24-25]。因此，現(xiàn)在的研究者多采用組織特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來代替組成型啟動(dòng)子。

目前，已有許多關(guān)于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Rd29A應(yīng)用在植物轉(zhuǎn)基因研究中的報(bào)道，高世慶等[26]將Rd29A啟動(dòng)子控制GUS報(bào)告基因的表達(dá)載體，通過基因槍介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到小麥的幼胚愈傷組織中，在PEG脅迫條件下進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，證實(shí)了Rd29A啟動(dòng)子能在小麥愈傷組織中誘導(dǎo)GUS基因表達(dá)。李新玲等[27]從擬南芥基因組中擴(kuò)增到Rd29A啟動(dòng)子，并將其與GUS基因融合構(gòu)建成雙元植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草品種龍江851，結(jié)果表明，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)15% PEG和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% NaCl脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因煙草的GUS表達(dá)量明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株。李雙等[28]分別構(gòu)建了誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Rd29A和組成型啟動(dòng)子CaMV35S驅(qū)動(dòng)的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因(ipt)的植物表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到煙草中，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)Rd29A啟動(dòng)子的植株在4 ℃低溫誘導(dǎo)條件下,能夠很好的調(diào)控ipt基因的表達(dá)，與轉(zhuǎn)Rd29A-ipt植株在常溫處理以及對(duì)照載體在低溫和常溫處理之間差異顯著，而CaMV35S誘導(dǎo)的ipt基因過量表達(dá)使植物的生長(zhǎng)受到抑制。本研究采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Rd29A構(gòu)建載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，目的是減少目標(biāo)基因過量表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)造成的不良影響。

目前，淡水資源缺乏已成為世界范圍內(nèi)一個(gè)不容忽視的問題，而農(nóng)業(yè)用水量高達(dá)淡水資源的70%，因此通過遺傳改良，提高作物抗旱性，對(duì)于緩解我國(guó)農(nóng)業(yè)用水困境有著極為重要的意義。ABA作為植物體內(nèi)的5大生長(zhǎng)激素之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及響應(yīng)水分脅迫、鹽脅迫中有重要作用[16]。因此，ABA信號(hào)通路一直是植物科學(xué)領(lǐng)域的一大研究熱點(diǎn)。本研究轉(zhuǎn)化小麥所用外源目標(biāo)基因PYL5是從擬南芥中克隆的ABA受體蛋白編碼基因，其表達(dá)的蛋白通過與ABA結(jié)合能夠抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)的活性，PP2C在ABA信號(hào)傳導(dǎo)中起著負(fù)調(diào)控的作用，它通過抑制SNF1(Sucrose-Nonfermenting Kinase1)相關(guān)蛋白激酶2(SnRK2)的活性來抑制ABA信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)；PYL5基因在植物體內(nèi)的表達(dá)能夠使ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑順利進(jìn)行，產(chǎn)生的ABA有促進(jìn)氣孔關(guān)閉、水分吸收等生理作用，進(jìn)而提高植物的抗旱性[18-19]。本研究采用基因槍介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化方法，成功地將由Rd29A驅(qū)動(dòng)的擬南芥PYL5基因轉(zhuǎn)入小麥品種西農(nóng)889、綿陽(yáng)19和寧春16中，共獲得了7株轉(zhuǎn)基因T0代陽(yáng)性植株(西農(nóng)889有2株，綿陽(yáng)19有1株，寧春16有 4株)。擬南芥的PYL5基因能否在轉(zhuǎn)基因小麥的基因組上整合并穩(wěn)定遺傳，以及目標(biāo)基因能穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因后代株系的抗旱性如何，都需要進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)結(jié)果為研究轉(zhuǎn)PYL5基因小麥的遺傳穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)基因小麥的抗旱性奠定了基礎(chǔ)。

[1] 梁新華,徐兆楨,許 興,等.小麥抗旱生理研究現(xiàn)狀與思考 [J].甘肅農(nóng)業(yè)科技,2001(2)：24-28.

Liang X H,Xu Z Z,Xu X,et al.Research status and thinking on drought-resistant physiology of wheat [J].Gansu Agricultural Science and Techonology,2001(2):24-28.(in Chinese)

[2] Boyer J S.Plant productivity and environment [J].Science,1982,218(4571):443-448.

[3] 葉興國(guó),程紅梅,徐惠君,等.轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶和β-1,3葡聚糖酶雙價(jià)基因小麥的獲得和鑒定 [J].作物學(xué)報(bào),2005,31(5):583-586.

Ye X G,Cheng H M, Xu H J,et al.Development of transgenic wheat plants with chitinase and β-1,3 glucosanase genes and their resistance to fusarium head blight [J].Acta Agronomica Sinica,2005,31(5):583-586.(in Chinese)

[4] 周淼平,周小青,張?jiān)銎G,等.TaPIMP1過量表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因小麥紋枯病抗性的研究 [J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2011,25(3):421-426.

Zhou M P,Zhou X Q,Zhang Z Y,et al.Over-expression ofTaPIMP1 enhanced resistance to wheat sharp eyespot in transgenic wheat [J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2011,25(3):421-426.(in Chinese)

[5] 黨 良,王愛云,徐惠君,等.抗根腐病的轉(zhuǎn)GmPGIP3基因小麥揚(yáng)麥18的獲得與鑒定 [J].作物學(xué)報(bào),2012,38(10):1833-1838.

Dang L,Wang A Y,Xu H J,et al.Development and characterization ofGmPGIP3 transgenic Yangmai 18 with enhanced resistance to wheat common root rot [J].Acta Agronomica Sinica,2012,38(10):1833-1838.(in Chinese)

[6] 畢瑞明,賈海燕,封德順,等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)抗儲(chǔ)糧害蟲轉(zhuǎn)基因小麥(TriticumaestivumL.)的獲得和分析 [J].生物工程學(xué)報(bào),2006,22(3):431-437.

Bi R M,Jia H Y,Feng D S,et al.Transgenic wheat (TriticumaestivumL. ) with increased resistance to the storage pest obtained byAgrobacteriumtumefaciensmediated [J].Chinese Journal of Biotechnology,2006,22(3):431-437.(in Chinese)

[7] 張 彥,喻修道,唐克軒,等.用基因槍法獲得轉(zhuǎn)異天南星基因aha抗蚜蟲小麥 [J].作物學(xué)報(bào),2012,38(8):1538-1543.

Zhang Y,Yu X D,Tang K X,et al.Generation of aphid resistant transgenic wheat withahafromArisaemaheterophyllumby particle bombardment [J].Acta Agronomica Sinica,2012,38(8):1538-1543.(in Chinese)

[8] 陳紅敏,陳 明,魏安智,等.抗逆相關(guān)基因GmAREB轉(zhuǎn)基因小麥的獲得和鑒定 [J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2010,11(6):749-754.

Chen H M,Chen M,Wei A Z,et al.Molecular and functional analysis of transgenic wheat transformed with stress-related geneGmAREB[J].Journal of Plant Genetic Resources,2010,11(6):749-754.(in Chinese)

[9] 喻修道,徐兆師,陳 明,等.小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究及其應(yīng)用 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(8):1539-1553.

Yu X D,Xu Z S,Chen M,et al.The progress and application of wheat transformation technology [J].Scientia Agricultura Sinica,2010,43(8):1539-1553.(in Chinese)

[10] 劉香利,金偉波,劉 縉,等.高分子量麥谷蛋白亞基基因1Bx14轉(zhuǎn)化小麥 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(21):4350-4357.

Liu X L,Jin W B,Liu J,et al.Transformation of wheat with high molecular weight glutenin subunit gene 1Bx14 [J].Scientia Agricultura Sinica,2011,44(21):4350-4357.(in Chinese)

[11] 王海鳳,韓 冉,張東武,等.基因槍法介導(dǎo)轉(zhuǎn)ZmalⅠ基因小麥植株的獲得和鑒定 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011,39(8):90-94.

Wang H F,Han R,Zhang D W,et al.Acquisition and identification of wheat withZmalⅠ gene by biolistic particle and molecular identification [J].Journal of Northwest A&F University:Natural Science Edition,2011,39(8):90-94.(in Chinese)

[12] Hu L,Li Y,Xu W G,et al.Improvement of the photosynthetic characteristics of transgenic wheat plants by transformation with the maize C4 phosphoenolpyruvate carboxylase gene [J].Plant Breeding,2012,131(3):385-391.

[13] Pellegrineschi A,Reynolds M,Pacheco M,et al.Stress-induced expression in wheat of theArabidopsisthalianaDREB1Agene delays water stress symptoms under greenhouse conditions [J].Genome,2004,47:493-500.

[14] Hmida-Sayari,Radhia Gargouri-Bouzid,Amira Bidani Jaoua,et al.Over- expression of D1-pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline production and confers salt tolerance in transgenic potato plants [J].Plant Science,2005,169(4):746-752.

[15] He C M,Zhang W W,Gao Q,et al.Enhancement of drought resistance and biomass by increasing the amount of glycine betaine in wheat seedings [J].Euphytica,2011,177(2):151-167.

然而，再回頭看看潘岳因趨炎附勢(shì)而橫遭政敵滅門的下場(chǎng)，衛(wèi)玠因身體羸弱而南渡累死途中的結(jié)局，慕容沖因輕率冒進(jìn)薄德寡恩而死于亂軍的凄涼，獨(dú)孤信因權(quán)力傾軋不明哲保身而未能善終的遺憾，都似乎讓我看到了顏值在對(duì)命運(yùn)的把握和對(duì)社會(huì)的貢獻(xiàn)面前的脆弱和無能為力，更不用說四大美女全部淪為政治犧牲品的可憐結(jié)局了。最后人們談?wù)摰臍v史名人，還是秦皇、漢武、唐宗、宋祖，這些為民族做出重大貢獻(xiàn)的人物，還是姜尚、屈原、張良、李靖，這些德才兼?zhèn)洹⒋笾谴笥碌娜宋铩?/p>

[16] Morillon R,Chrispeels M.The role of ABA and the transpiration stream in the regulation of the osmotic water permeability of leaf cells [J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(24):14138-14143.

[17] 張 會(huì).脫落酸在植物抗性生理中的作用 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(2):490-491,527.

Zhang H.Role of abscisic acid in plant hardiness physiology [J].Journal of Anhui Agri Sci,2013,41(2):490-491,527.(in Chinese)

[18] 胡 帥,王芳展,劉振寧,等.PYR/PYL/RCAR蛋白介導(dǎo)植物ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) [J].遺傳,2012,34(5)：560-572.

Hu S,Wang F Z,Liu Z N,et al.ABA signaling mediated by PYR/PYL/RCAR in plants [J].Hereditas,2012,34(5)：560-572.(in Chinese)

[19] Raghavendra A S,Gonugunta V K,Christmann A,et al.ABA perception and signalling [J].Trends in Plant Sci,2010,15(7):395-401.

[20] Hubbard K E,Nishimura N,Hitomi K,et al.Early abscisic acid signal transduction mechanisms:Newly discovered components and newly emerging questions [J].Genes Dev,2010,24(16):1695-1708.

[22] 王 敏,那冬晨,姬虎太,等.快速小量提取小麥葉片DNA的一種簡(jiǎn)易方法 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(35):17384-17385.

Wang M,Na D C,Ji H T,et al.A simple and quick method of extracting genomic DNA from wheat leaf [J].Journal of Anhui Agri Sci,2009,37(35):17384-17385.(in Chinese)

[23] 路 靜,趙華燕,何奕昆,等.高等植物啟動(dòng)子及其應(yīng)用研究進(jìn)展 [J].自然科學(xué)進(jìn)展,2004,14(8):856-862.

Lu J,Zhao H Y,He Y K,et al.The research progress of higher plant promoter and its application [J].Progress in Natural Science,2004,14(8):856-862.(in Chinese)

[24] 郝 林,曹 軍.CaMV35S雙啟動(dòng)子顯著提高轉(zhuǎn)基因在擬南芥中表達(dá)水平的研究 [J].植物生理學(xué)通訊, 2000,36(6):517-519.

Hao L,Cao J.A doubleCaMV35Spromoter efficiently enhances the level of transgenic expression inArabidopsis[J].Plant Physiology Communications,2000,36(6):517-519.(in Chinese)

[25] Matzke M A,Matzke A J M.How and why do plants inactivate homologuous transgenes [J].Plant Physiol,1995,107(3):679-685.

[26] 高世慶,陳 明,馬有志,等.Rd29A啟動(dòng)子在小麥幼胚愈傷組織中的活性研究 [J].作物學(xué)報(bào),2005,31(2):150-153.

Gao S Q,Chen M,Ma Y Z,et al.Activity ofRd29Apromoter in wheat immature embryonic calli [J].Acta Agronomica Sinica,2005,31(2):150-153.(in Chinese)

[27] 李新玲,楊傳平,曲 敏,等.Rd29A啟動(dòng)子的克隆及提高煙草抗逆性的研究 [J].分子植物育種,2007,5(1):37-42.

Li X L,Yang C P,Qu M,et al.Study on cloning ofRd29Apromoter and enhancing stress tolerance of tobacco [J].Molecular Plant Breeding,2007,5(1):37-42.(in Chinese)

[28] 李 雙，石 君，張秀海，等.逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Rd29A誘導(dǎo)ipt基因轉(zhuǎn)化煙草的研究 [J].分子植物育種,2011,9(1):51-56.

Li S,Shi J,Zhang X H,et al.Studies on stress inducible promoterRd29Ainduction ofipttransgenic tobacco [J].Molecular Plant Breeding,2011,9(1):51-56.(in Chinese)

Transformation of wheat withPYL5 gene by biolistic particles and its molecular identification

CHI Qinga,ZHOU Penga,LIU Xiang-lia,b,Cheng Hui-huia,ZHAO Hui-xiana,b

(aCollegeofLifeSciences,bStateKeyLaboratoryofCropStressBiologyforAridAreas,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The purpose of this study was to obtain transgenic wheat withPYL5 gene based on by biolistic particles.【Method】 Wheat cultivars including Xinong 889,Mianyang 19 and Ningchun 16 were used as acceptors,PYL5 andBargenes were co-transformed into immature callus by biolistic particles.After herbicide selection (Phosphinothricin,PPT) and callus differentiation,the regenerated plants were obtained.Then,allele specific PCR (AS-PCR) was conducted to analyze T0generation of regenerated plants using primers designed according to sequences of target genes.【Result】 1 800 callus of Xinong 889,800 callus of Mianyang 19 and 800 callus of Ningchun 16 were bombarded by biolistic particles,and 9,5 and 14 regenerated plants were obtained,respectively.The regenerated plants were tested using allele specific PCR (AS-PCR) and the obtained transformation frequencies ofBar,PYL5 gene for Xinong 889,Mianyang 19 and Ningchun 16 were 0.280%,0.500%,and 0.750%;0.110%,0.125%,0.500%,respectively,The co-transformation frequencies ofBarandPYL5 were 0.110%,0.125% and 0.500%,respectively.【Conclusion】PYL5 gene was successfully transformed into wheat cultivars Xinong 889,Mianyang 19 and Ningchun 16.

wheat;biolistic particle;co-transformation;PYL5 gene

2013-11-01

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2011ZX08002-004)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101205)；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng) (QN2011111)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471482)

池 青(1988-)，女，河南周口人，在讀碩士，主要從事作物遺傳改良的分子基礎(chǔ)研究。 E-mail：cq1003270059@163.com

趙惠賢(1965-)，女，陜西臨潼人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事作物重要性狀相關(guān)基因及其功能研究。 E-mail：hxzhao212@nwsuaf.edu.cn

時(shí)間:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.008

S512.1；Q785

A

1671-9387(2015)02-0072-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.008.html