郭夢南，宋冬冬，張曉敏，石亞楠，孟衛(wèi)新，王麗娜?

（1.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2013級，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2011級；3.指導(dǎo)教師）

大量收集旋毛蟲成蟲的改良方法探討

郭夢南1，宋冬冬1，張曉敏1，石亞楠2，孟衛(wèi)新2，王麗娜3?

（1.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2013級，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2011級；3.指導(dǎo)教師）

旋毛蟲；成蟲；收集

目前，旋毛蟲病流行程度加重，流行區(qū)在不斷擴(kuò)大，發(fā)病率有逐步升高的趨勢［1-2］。旋毛蟲抗原具有特異性，成分極其復(fù)雜，而且患者的臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜，因此，給旋毛蟲病免疫診斷及預(yù)防帶來困難［3］。有研究顯示，成蟲抗原和新生幼蟲抗原具有更好的免疫原性，而成蟲抗原有可能成為較理想的免疫疫苗來源［4］。若要對成蟲抗原進(jìn)行研究，前提就是收集大量而又純凈的旋毛蟲成蟲作為研究材料。因此，我們對旋毛蟲的收集方法進(jìn)行了研究，找到了一種大量收集旋毛蟲成蟲的方法，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 旋毛蟲來源 旋毛蟲種由本院病原生物學(xué)教研室小鼠傳代保種。

1.2 實驗動物 昆明雄性健康成年小鼠，20-25g，購自承德醫(yī)學(xué)院實驗動物中心；SD雄性健康成年大鼠，180-220g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.3 主要試劑及儀器 胃蛋白酶（1：3000），上海生工生物工程有限公司；濃鹽酸，天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司；氯化鈉，天津市佳興化工玻璃儀器有限公司。組織搗碎機(jī)，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；恒溫水浴箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科學(xué)儀器有限公司。

1.4 旋毛蟲囊包幼蟲的分離 處死旋毛蟲保種的昆明小鼠，分離出全身肌肉，將肌肉剪碎，置于組織搗碎機(jī)，2000r/ min，15s搗碎。用1%胃蛋白酶-1%鹽酸的消化液按1：30（肌肉：消化液）比例配制，置于7℃水浴箱中，消化小鼠肌肉4-6h。待肌肉消化完全后，消化液經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾到錐形量筒中，水洗自然沉淀后獲取旋毛蟲囊包幼蟲并計數(shù)。

1.5 旋毛蟲成蟲的收集 用收集到的囊包幼蟲經(jīng)口感染大鼠，10000條/只。第6d禁食，第7d在乙醚麻醉下處死大鼠，取其全部小腸，縱向剪開，在無菌生理鹽水中輕輕漂洗，除掉腸內(nèi)容物。將小腸片段鋪在懸于燒杯上的4層紗布上（紗布低于燒杯口5cm左右），加入孵育液（無菌生理鹽水），以剛好沒過小腸為準(zhǔn)。將燒杯置于37℃恒溫箱孵育4h，這期間大部分成蟲主動從小腸粘膜內(nèi)鉆出，并穿過紗布進(jìn)入到生理鹽水中。3h后可見燒杯底部有大量白色團(tuán)塊狀沉淀，即為旋毛蟲成蟲。移去紗布及小腸，將孵育液倒入錐形量筒中，自然沉淀30min，棄上清，無菌生理鹽水反復(fù)洗滌沉淀2-3次，200目篩網(wǎng)過濾，將篩子倒置，用無菌生理鹽水沖洗紗網(wǎng)，洗下成蟲，將濾液自然沉淀10min，棄上清，收集干凈成蟲。鏡下觀察活力并計數(shù)。

2 結(jié)果

10只成年大鼠，每只大鼠感染10000條旋毛蟲囊包幼蟲。共獲得純凈的成蟲約53810條，回收率53.81%。鏡下觀察，成蟲運動活潑，脫落的腸粘膜極少。

3 討論

旋毛蟲孵育時間太短則溢出的成蟲量少，孵育時間太長則小腸容易腐敗變性，增加細(xì)菌污染的機(jī)會。劉俊琴等［5］研究顯示，成蟲在孵育4h過程中基本從腸粘膜鉆出，所以本研究取4h為旋毛蟲孵育時間。

雖然劉俊琴等［5］對旋毛蟲成蟲無菌分離和體外培養(yǎng)方法進(jìn)行了改進(jìn)，但由于其過程比較繁瑣，操作起來有一定的難度。我們的這次實驗不但收集方法得到了簡化，同時能夠有效地收集純凈的成蟲，而且操作時間短，蟲體活力保持較好，這也有利于下一步旋毛蟲成蟲的體外培養(yǎng)及新生幼蟲的收集，有利于旋毛蟲的免疫學(xué)及分子生物學(xué)等方面的研究。

［1］許隆祺，蔣則孝，余素梅，等.當(dāng)前我國人體寄生蟲病流行的趨勢和特點［J］.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1995，13（3）：214-217.

［2］溫艷，張月清.聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測旋毛蟲DNA的實驗研究［J］.中國人獸共患病雜志，2001，17（1）：61-62.

［3］Orlega-Pienes MG，Yepez-Mulia L，Human W， et al.Workshop on a detailed characterization of Trichinella spiralis antigens：A platform for future studies on antigens and antibodies to this parasite［J］.Parasite Immunol，1996，18（6）：273-284.

［4］涂濤，安桂珍，楊樹森.旋毛蟲成蟲、新生幼蟲和肌幼蟲抗原的保護(hù)性免疫研究［J］.中國人獸共患病雜志，2001，17（2）：66-69.

［5］劉俊琴，李科榮，申麗潔.無菌分離和體外培養(yǎng)旋毛蟲成蟲方法的改進(jìn)［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2008，3（8）：623-624.

（學(xué)生園地欄目編輯：張 ?。?/p>

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1004-6879（2015）02-0169-02

2015-01-26）