張紅茹，孫 琳

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193； 2.天津中新藥業(yè)研究中心，天津 300457)

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HPLC法測(cè)定枇杷葉中一種橙花叔醇苷的含量

張紅茹1,2，孫 琳2

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193； 2.天津中新藥業(yè)研究中心，天津 300457)

目的：建立HPLC法測(cè)定枇杷葉中倍半萜苷—橙花叔醇苷的含量。方法：采用HPLC法測(cè)定，色譜柱為Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水(29∶71)；體積流量1.0 ml/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。結(jié)果：倍半萜苷在0.009 629～2.006 μg/ml(r=0.999 6)范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為96.23%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，專屬性好，可用于枇杷葉的質(zhì)量控制。

枇杷葉,倍半萜苷,橙花叔醇苷,含量測(cè)定,HPLC

枇杷葉Eriobotryaefolium為薔薇科植物枇杷的干燥葉，具有清肺止咳，降逆止嘔的功效，用于治療肺熱咳嗽，氣逆喘急，胃熱嘔逆，煩熱口渴[1]。枇杷葉的化學(xué)成分主要有三萜酸類、倍半萜及其苷類、多酚類、黃酮類以及糖苷類，具有抗炎止咳、抗病毒、降血糖和抗腫瘤等藥理活性[2]。

目前報(bào)道的枇杷葉含量測(cè)定成分以齊墩果酸、熊果酸等三萜酸類多見[3-5]，也有苦杏仁苷、綠原酸、槲皮素和山奈酚等[6-8]?！吨袊?guó)藥典》中其含量測(cè)定是以熊果酸和齊墩果酸的三萜酸類為質(zhì)控指標(biāo)，但此成分在眾多植物如山楂、女貞子、白花蛇舌草中均有存在且含量較高[9]，故其作為質(zhì)控指標(biāo)專屬性較低。本文旨在對(duì)枇杷葉中橙花叔醇-3-O-{α-1-吡喃鼠李糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}進(jìn)行HPLC法測(cè)定及方法學(xué)考查，以建立該倍半萜苷橙花叔醇苷的含量測(cè)定方法，因其為枇杷葉的特征成分，在枇杷葉中比上述其他成分更具專屬性，可作為枇杷葉質(zhì)量控制指標(biāo)的有效補(bǔ)充，為質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀(Waters公司)；AL204-IC型萬分之一天平(Mettler公司)；HU10260B型超聲儀(天津恒奧科技有限公司)。

1.2 試藥 枇杷葉藥材(批號(hào)Y-1211-0149，Y-1406-0113，140501,購(gòu)自天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司藥材分公司)；橙花叔醇-3-O-{α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}(實(shí)驗(yàn)室自制，純度≥98%，以下稱為橙花叔醇苷)；乙腈(色譜純，天津康科德科技有限公司)；水為純凈水(Millipore純水機(jī)制備)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相乙腈-水(29∶71)；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫30 ℃；體積流量1.0 ml/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取橙花叔醇苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解，配制成0.1 mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取枇杷葉粉末(批號(hào)Y-1211-0149，過三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇25 ml，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用水飽和正丁醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 ml，置蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性 分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，結(jié)果見圖1。

1.橙花叔醇苷

2.4 線性關(guān)系考查 分別精密吸取濃度為0.009 628 8、0.032 096、0.080 24、0.160 48、0.401 2、0.802 4和2.006 mg/ml的對(duì)照品溶液各10 μl，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定峰面積，記錄數(shù)據(jù)。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=3 700 000X+20 494(r=0.999 6)，結(jié)果表明橙花叔醇苷在0.009 629～2.006 mg/ml濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μl，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其色譜峰的峰面積，計(jì)算RSD為0.52%，說明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同批枇杷葉樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、3、6、9、12、15、18 h進(jìn)樣10 μl，測(cè)定其色譜峰的峰面積，計(jì)算RSD為1.10%，說明供試品溶液在0～18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批枇杷葉樣品6份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為0.56%，說明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的供試品0.25 g，加入一定量的對(duì)照品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為96.23%，RSD為1.20%，結(jié)果見表1。

表1 橙花叔醇苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測(cè)定 取3批枇杷葉，精密稱定，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定橙花叔醇苷的含量，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行200～400 nm全譜測(cè)定，結(jié)果橙花叔醇苷在紫外光譜中只具末端吸收，為減少溶劑及雜質(zhì)干擾，故選擇210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 由于甲醇、甲酸和乙酸等溶劑在210 nm附近均有紫外吸收，對(duì)本成分的測(cè)定會(huì)有干擾，故選擇乙腈水作為流動(dòng)相，通過流動(dòng)相比例及不同色譜柱的考查，最終確定了基線平穩(wěn)，峰形較好，保留時(shí)間適中的流動(dòng)相系統(tǒng)。

3.3 提取溶劑和方法的選擇 在實(shí)驗(yàn)過程中考查了分別以100%、70%、50%甲醇及水飽和正丁醇超聲提取，結(jié)果表明70%、50%甲醇及水飽和正丁醇提取率相當(dāng)，但70%、50%甲醇提取雜質(zhì)較多，故選擇水飽和正丁醇作為提取溶劑。又考查了以水飽和正丁醇為溶劑超聲和加熱回流的提取情況，結(jié)果表明超聲提取30 min即可提取完全。

枇杷葉中倍半萜苷—橙花叔醇-3-O-{α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}是由意大利學(xué)者De Tommasi等[10]從枇杷葉中首次分離得到，并證實(shí)其有降低血糖的作用[11]。其苷元橙花叔醇也是枇杷葉中揮發(fā)油的主要成分[12]，具有抗菌作用[13]，與枇杷葉已知療效相關(guān)，橙花叔醇苷有可能在體內(nèi)代謝為橙花叔醇，間接發(fā)揮療效，但還需進(jìn)一步證實(shí)。目前枇杷葉含量測(cè)定的指標(biāo)成分多為三萜酸類，但中藥常用水提或水煎煮后服用，使用脂溶性很強(qiáng)的熊果酸等三萜酸類顯然不太合理，本文建立水溶性的橙花叔醇苷含量測(cè)定的方法，以橙花叔醇苷作為枇杷葉的質(zhì)控指標(biāo)，可以更合理的控制其質(zhì)量。

1 中國(guó)藥典[S]. 一部.2010：190-191

2 陸林博. 枇杷葉的化學(xué)成分研究[D]. 南京師范大學(xué),2006：10-12

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Determination of nerolidol glycosides inEriobotryaefoliumby HPLC

Zhanghongru1,2，Sunlin2

(1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193；2.Tianjin Zhongxin Pharmaceuticals R&D Center,Tianjin 300457)

Objective： To establish an HPLC method for determination of a sesquiterpene glycosides-nerolidol glycosides inEriobotryaefolium.Methods： HPLC was applied with the chromatographic condition as follows:The chromatographic column was Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)at 30 ℃;acetonitrile-water(29∶71) as the mobile phase;flow rate was 1.0 ml/min and the detection wavelength was 210 nm.Results： Linear relationships was 0.009 629～2.006 μg(r=0.999 6),the average recovery was 96.23%.Conclusion： The method is convenient,accurate and specific,can be applied to the quality control ofEriobotryaefolium.

Eriobotryaefolium，sesquiterpene glycosides，nerolidol glycosides，quantitative determination，HPLC

2015-03-17

R927.2

A

1006-5687(2015)03-0009-03