王瑞靜，李瑞明

(天士力控股集團(tuán)研究院，天津 300402)

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HPLC法測定連夏消痞顆粒中鹽酸小檗堿的含量

王瑞靜，李瑞明

(天士力控股集團(tuán)研究院，天津 300402)

目的：建立HPLC法測定連夏消痞顆粒中鹽酸小檗堿的含量。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱：Agilent zorbax C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相：乙腈-磷酸鹽緩沖液(27∶73)；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：345 nm。 結(jié)果：鹽酸小檗堿進(jìn)樣濃度在1.76～70.31 μg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=3 938.1X+6.528(r=0.999),平均回收率為99.88%， RSD為2.84%。結(jié)論：本方法簡便可行，靈敏度高，重復(fù)性好，可用于連夏消痞顆粒中鹽酸小檗堿的含量測定。

連夏消痞顆粒，鹽酸小檗堿，HPLC，含量測定

連夏消痞顆粒是由法半夏、黃連、干姜等8味中藥材制成的中藥復(fù)方制劑，具有健脾和胃、消除脹滿之功效，本方為辛開苦降，寒熱并用，陰陽并調(diào)，主治脾胃不和寒熱錯雜之痞。方中黃連所含鹽酸小檗堿為其活性成分，本試驗參考有關(guān)文獻(xiàn)[1-6]，采用HPLC 法測定連夏消痞顆粒中鹽酸小檗堿的含量，方法簡便快速、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，為控制產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥：

1.1 儀器 Agilent 1100系列高效液相色譜儀，紫外檢測器，色譜柱：Agilent zorbax C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，電子分析天平： METTER Toledo Ag 135型，KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)， Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore)。

1.2 試藥 鹽酸小檗堿對照品 (中國藥品生物制品檢定所, 批號110713-200911，純度為86.8%)；乙腈、甲醇為色譜純(MERCK)，其余試劑均為分析純，水為二純水。連夏消痞顆粒(規(guī)格7 g/袋，批號20120401、20120402、20120403)為本公司制備的中試樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent zorbax C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相：乙腈-磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉7.8 g 加水溶解至1 000 ml，用磷酸調(diào)至pH 3.0)(27∶73)，流速：1.0 ml/min，柱溫：30 ℃。檢測波長345 nm；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品13.13 mg，加甲醇定容至25 ml，精密吸取1 ml稀釋到50 ml，濃度為0.010 5 mg/ml的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品研磨，精密稱取粉末約0.1 g，精密稱定，置100 ml 量瓶中，加入鹽酸-甲醇(1∶100) 約95 ml，超聲處理30 min，放置至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取缺黃連的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.3 方法專屬性試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，依法進(jìn)樣測定，記錄液相色譜圖，見圖1。陰性對照在鹽酸小檗堿對照品相同保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考查 精密稱取鹽酸小檗堿對照品(純度86.8%)8.10 mg,置100 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得70.31 μg/ml的對照品溶液(儲備液)。取儲備液稀釋得濃度分別為70.31、35.16、17.58、8.79、3.52和1.76 μg/ml的溶液， 分別精密吸取上述溶液各10μl，注入液相色譜儀，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣濃度對峰面積進(jìn)行線性回歸， 得回歸方程：Y=3 938.1X+6.528(r=0.999)，結(jié)果表明鹽酸小檗堿進(jìn)樣濃度在1.76～70.31 μg/ml范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

1.鹽酸小檗堿

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液10 μl，按照“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算精密度，結(jié)果RSD 為0.70%，表明該儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液，室溫放置， 精密吸取供試品溶液10 μl，按照“2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、6、12和24 h進(jìn)樣，共測定6次，測定峰面積，計算穩(wěn)定性，結(jié)果RSD 為0.79%，結(jié)果表明供試品溶液在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重現(xiàn)性試驗 取同一批號(批號201204016)樣品6份，分別按“2.2.2”項下制備成供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件測定，RSD為0.67%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取顆粒6份，每份0.05 g，精密量取0.093 4 mg/ml的鹽酸小檗堿對照品溶液4 ml，分別加入到6份樣品中，制備供試品溶液，并計算加樣回收率。得平均加樣回收率99.88%，RSD為2.84%。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.9 樣品含量測定 取3批連夏消痞顆粒中試樣品，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 流動相配比 色譜條件的選擇系參照《中國藥典》2010版一部黃連藥材中鹽酸小檗堿的含量測定方法：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(50∶50)(每100 ml中加十二烷基硫酸鈉0.4 g,再以磷酸調(diào)節(jié)pH 值為4.0)為流動相；檢測波長為345 nm,在此基礎(chǔ)上,本實驗又通過對流動相進(jìn)行深入考查，選擇乙腈-磷酸二氫鈉溶液，不同比例，調(diào)節(jié)不同pH值的配比，最終選取最優(yōu)比例乙腈-磷酸鹽緩沖液27∶73(磷酸調(diào)節(jié)pH值為3)，作為流動相，結(jié)果鹽酸小檗堿與其他峰分離度均大于2,分離效果良好，保留時間適宜，重現(xiàn)性好。

3.2 供試品溶液制備方法 供試品溶液制備方法以鹽酸小檗堿的提取率為指標(biāo)，分別考查了提取方法(超聲提取、加熱回流提取)、提取溶劑(甲醇、不同比例的鹽酸-甲醇、不同比例的乙醇- 水)、提取溶劑倍數(shù)和提取時間。結(jié)果采用鹽酸-甲醇(1∶100) 95 ml 超聲處理30 min 可以將鹽酸小檗堿提取完全，故選擇該法作為供試品溶液制備方法。

本研究建立的鹽酸小檗堿的檢驗方法，操作簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，為連夏消痞顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 劉善新，靳光乾，王亮.三黃湯制爐甘石中鹽酸小檗堿的含量測定[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2013,19(13): 107-109

2 高聰聰，許閩，周悌強(qiáng)，等.四方胃膠囊中鹽酸小檗堿的含量測定[J].河南中醫(yī)學(xué)報, 2013,28(12): 1860-1861

3 馮果，劉文，陳登科，等.香連丸中鹽酸小檗堿的含量測定[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2011,33(4): 7-9

4 葉秀金，宋粉云.HPLC測定清肺抑火丸中鹽酸小檗堿的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志, 2011,17(3): 90-92

5 陳慶輝，唐元軍.知柏地黃丸中鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的含量測定[J].藥物分析雜志,2012，32(12):2198-2202

6 劉淑萍，褚連軍.冬黃顆粒劑的制備及其含量測定[J].中國生化藥物雜志,2010,31(4): 263-265

2014-08-08

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1006-5687(2015)01-0017-02