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CKS1siRNA聯(lián)合化療藥物對(duì)舌癌Tca8113細(xì)胞中CKS1蛋白表達(dá)影響的研究

徐亞娟1,李兆東2,高元奇2,張叢笑3,倫志軍3,畢崇才3,劉文書(shū)3*

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春130012；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春130021；

3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春130021)

舌癌是口腔頜面部常見(jiàn)的惡性腫瘤，治療效果不理想。目前，舌癌的治療主要是以手術(shù)和放、化療為主[1]，其中化療是目前有效綜合治療舌癌的一個(gè)重要的方法，但化療藥物的應(yīng)用存在耐藥和毒副作用等，限制了其用量和時(shí)間[2,3]。近年來(lái)的研究表明[4]，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是細(xì)胞周期調(diào)控因子異常導(dǎo)致的細(xì)胞周期紊亂，因此，尋找有關(guān)的調(diào)控因子，并將其作為目的基因與放化療相結(jié)合，對(duì)腫瘤治療具有重要意義。

CKS1是細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶的亞基，能與其他細(xì)胞周期蛋白激酶和磷酸化蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞周期調(diào)控，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]?，F(xiàn)在的研究擬通過(guò)CKS1 siRNA轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞并加用化療藥物，以觀察CKS1 siRNA對(duì)化療藥物的增效作用。

1材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

人舌癌Tca8113細(xì)胞系購(gòu)自北京博楓科生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。平陽(yáng)霉素(哈爾濱萊博通藥業(yè)有限公司)，順鉑(山東羅欣藥業(yè)股份有限公司)，氟尿嘧啶(修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司)，長(zhǎng)春新堿(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)，胰蛋白酶(蘇州新寶制藥有限公司)。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人舌癌Tca8113細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合時(shí)，用0.25%胰酶(含1% EDTA)消化，經(jīng)離心后制成單細(xì)胞懸液，以1∶4比例傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CKS1 siRNA 轉(zhuǎn)染CKS1 siRNA有意義鏈：5’-UGGAGGAAUCUUGGCGUUCUUTT-3’；對(duì)照鏈：5’-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3’由上海GenePharma公司合成，同時(shí)對(duì)siRNA序列進(jìn)行2'Ome修飾(穩(wěn)定化學(xué)結(jié)構(gòu))和5'FAM修飾(綠色熒光)，具體實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按GenePharma siRNA-MateTM和siRNA-MateTM轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行。

1.2.3化療藥物對(duì)Tca8113細(xì)胞的作用將Tca8113細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板，細(xì)胞分為：空白組、轉(zhuǎn)染組、平陽(yáng)霉素組、順鉑組、氟尿嘧啶組、長(zhǎng)春新堿組、平陽(yáng)霉素+siRNA組、順鉑+siRNA組、氟尿嘧啶+siRNA組、長(zhǎng)春新堿+siRNA 組共10組，每組3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞以每孔5×103個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板，在37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染聯(lián)合化療藥物組細(xì)胞先進(jìn)行CKS1-siRNA轉(zhuǎn)染，濃度為10 nM；其他各組正常培養(yǎng)。24 h后，藥物組分別加入4種藥物，具體濃度梯度按表1進(jìn)行。

表1　4種化療藥物的配制濃度

加藥后繼續(xù)在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后每孔加MTT溶液(5 mg/mL)20 μl，37℃孵育4 h，棄培養(yǎng)液后再加入150 μl DMSO，震蕩10 min，于酶標(biāo)儀(490 nm波長(zhǎng))測(cè)定各孔吸光值(OD值)，計(jì)算抑制率并根據(jù)公式計(jì)算轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞的半致死量(IC50)，同時(shí)根據(jù)半致死量的值用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4化療藥物對(duì)轉(zhuǎn)染后Tca8113細(xì)胞的CKS1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)及操作方法同前。然后收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)并對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量和變性，通過(guò)常規(guī)SDS-PAGE和Western blot對(duì)轉(zhuǎn)染后給予不同化療藥物的Tca8113細(xì)胞CKS1蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1　轉(zhuǎn)染前后4種化療藥物對(duì)Tca8113細(xì)胞的半數(shù)致死量

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，轉(zhuǎn)染CKS1 siRNA后，各化療藥物對(duì)Tca8113細(xì)胞的半致死劑量明顯低于未轉(zhuǎn)染組，其中以順鉑組差異更明顯。

2.2　轉(zhuǎn)染后4種化療藥物對(duì)Tca8113細(xì)胞CKS1蛋白表達(dá)水平的影響

圖像經(jīng)Imagej軟件分析灰度值，進(jìn)行半定量分析。各組之間的比值差異2倍以上認(rèn)定為有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3、圖1所示，轉(zhuǎn)染后再加入4種不同化療藥物的Tca8113細(xì)胞CKS1蛋白水平顯著下降，與對(duì)照和轉(zhuǎn)染siRNA組比較均有顯著性差異(P<0.05)，其中，藥物聯(lián)合siRNA協(xié)同作用對(duì)CKS1蛋白水平影響的強(qiáng)度由弱到強(qiáng)依次為：氟尿嘧啶聯(lián)合siRNA，平陽(yáng)霉素聯(lián)合siRNA，長(zhǎng)春新堿聯(lián)合siRNA，順鉑聯(lián)合siRNA。

表2　轉(zhuǎn)染前后四種化療藥物對(duì)Tca8113細(xì)胞的

表3　藥物聯(lián)合siRNA對(duì)Tca8113細(xì)胞Cks1蛋白水平的影響

—：轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體的對(duì)照組； N：轉(zhuǎn)染siRNA組； Cks：Cks1 siRNA轉(zhuǎn)染組；1：順鉑聯(lián)合siRNA組；

2：平陽(yáng)霉素聯(lián)合siRNA組；3：長(zhǎng)春新堿聯(lián)合siRNA組；4.氟尿嘧啶聯(lián)合siRNA組

圖1藥物聯(lián)合siRNA對(duì)Tca8113細(xì)胞Cks1蛋白水平的影響

3討論

惡性腫瘤的目前基因治療有如抑癌基因的附加、癌基因的抑制等[6],但由于腫瘤發(fā)病的多基因和多因素等原因，使基因治療的應(yīng)用受到限制。因此，將抗腫瘤相關(guān)基因與現(xiàn)在治療方法相結(jié)合使其能更好地發(fā)揮療效，是提高化療藥物對(duì)舌癌的敏感性的一個(gè)重要途徑。

2001年Ganoth等[7]首次發(fā)現(xiàn)cks1蛋白具有促進(jìn)p27蛋白泛素化降解功能。P27被認(rèn)為是一種抑癌基因。此外還具有調(diào)節(jié)腫瘤的耐藥、促進(jìn)凋亡、誘導(dǎo)分化等作用。張秀梅等[8]應(yīng)用免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)肝癌和胃腺癌中的CKS1及CKS1、P27蛋白進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在腫瘤中CKS1的表達(dá)增高，P27的表達(dá)降低，且與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度等有關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn)[9]，CKS1對(duì)細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相G1、S、G2、M期都有作用，其可能促進(jìn)G2/M期的細(xì)胞周期激酶抑制劑P27的集聚。本研究結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的半數(shù)致死劑量明顯低于轉(zhuǎn)染前，藥物聯(lián)合siRNA轉(zhuǎn)染的Tca8113細(xì)胞的CKS1蛋白表達(dá)顯著下降，表明藥物聯(lián)合siRNA轉(zhuǎn)染可有效抑制CKS1蛋白表達(dá)，可能通過(guò)防止p27蛋白泛素化降解，抑制腫瘤發(fā)展。為應(yīng)用CKS1 siRNA治療舌癌的研究提供了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的證據(jù)。

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(收稿日期：2015-02-08)

文章編號(hào)：1007-4287(2015)07-1054-03

*通訊作者

基金項(xiàng)目:吉林省發(fā)展和改革委員會(huì)資助(JF2012C006-8)