陳啟鑫，韓冠英，郭 斌，郭躍偉

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·論著·

不同濃度硝普鈉誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞凋亡模型的比較研究

陳啟鑫，韓冠英，郭 斌，郭躍偉

目的 比較不同濃度硝普鈉(SNP)誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞凋亡模型，為進(jìn)一步探討藥物對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用提供理論支持。方法 2014年9—12月選取4周齡健康雄性新西蘭大耳白兔8只，體質(zhì)量200～250 g，體外分離培養(yǎng)并鑒定兔軟骨細(xì)胞，采用不同濃度SNP(0、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 mmol/L)誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞，分別于12、24、48 h采用四甲基偶氮唑鹽比色試驗(yàn)法(MTT法)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)評(píng)價(jià)并比較不同濃度SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型，記錄兔軟骨細(xì)胞增殖情況(OD值)和兔軟骨細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 不同濃度SNP誘導(dǎo)的兔軟骨細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的OD值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SNP濃度為0.062 5、0.125 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時(shí)兔軟骨細(xì)胞OD值高于SNP濃度為0 mmol/L(P<0.05)；SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時(shí)兔軟骨細(xì)胞OD值均低于SNP濃度為0 mmol/L；SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時(shí)兔軟骨細(xì)胞OD值在不同濃度間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度SNP誘導(dǎo)的兔軟骨細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的凋亡率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時(shí)兔軟骨細(xì)胞凋亡率均高于SNP濃度為0 mmol/L(P<0.05)；且不同濃度間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 SNP濃度為0.25～2 mmol/L且誘導(dǎo)12、24、48 h時(shí)可制備不同嚴(yán)重程度的軟骨細(xì)胞凋亡模型，為進(jìn)一步探討藥物對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用提供了理論支持。

硝普鈉；軟骨細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

陳啟鑫，韓冠英，郭斌，等.不同濃度硝普鈉誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞凋亡模型的比較研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(24)：2939-2945.[www.chinagp.net]

Chen QX,Han GY,Guo B，et al.Rabbit chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of SNP[J].Chinese General Practice，2015，18(24)：2939-2945.

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是以關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解為特征的退行性關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚[1]。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中與修復(fù)破壞軟骨組織有關(guān)的細(xì)胞，在一定程度上能控制細(xì)胞外基質(zhì)的分布，對(duì)維持軟骨的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和組織結(jié)構(gòu)的完整性發(fā)揮著重要作用，軟骨細(xì)胞的凋亡是OA發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[2]。目前，體外常用于誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型的途徑有過氧化氫、白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和一氧化氮(NO)等，其中采用NO誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型是常用方法之一[3-6]。NO通過兩種途徑誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷，一種是抑制與線粒體呼吸傳遞系統(tǒng)及枸櫞酸循環(huán)相關(guān)的酶，另一種是抑制與超氧陰離子反應(yīng)生成氧化亞硝基的陰離子，其在一定條件下可分解為具有細(xì)胞毒性的OH-和NO2[7]。NO供體S-亞硝基-N-乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetylpenicillamine,SNAP)，即硝普鈉(SNP)，可產(chǎn)生外源性的NO，進(jìn)而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。采用SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型的方法雖有報(bào)道，但SNP的劑量和誘導(dǎo)時(shí)間各不相同，且對(duì)不同濃度SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡比較的研究較少，不利于不同嚴(yán)重程度凋亡模型的建立，進(jìn)而影響藥物對(duì)OA的療效判定及作用機(jī)制研究。本研究采用不同濃度SNP誘導(dǎo)兔膝骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡，以建立不同嚴(yán)重程度的凋亡模型，為進(jìn)一步篩選治療OA的藥物并評(píng)價(jià)其療效及作用機(jī)制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 研究材料 2014年9—12月選取4周齡健康雄性新西蘭大耳白兔8只，體質(zhì)量200～250 g，合格證號(hào)：Lnyxy20140507,由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置經(jīng)遼寧醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究試劑 Ⅱ型膠原酶、四甲基偶氮唑鹽〔3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT〕、SNP(購自美國Sigma公司)；DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(購自美國Gibco公司)；Alexa 555連接的羊抗兔二抗、4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(購自美國Invitrogen公司)；臺(tái)盼

本研究背景：

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是以關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解為特征的退行性關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前我國OA的患病人數(shù)已達(dá)到1.5億左右，是世界上OA患病人數(shù)最多的國家之一。OA導(dǎo)致的疼痛和功能障礙將影響患者的生活質(zhì)量并給家庭和社會(huì)帶來極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，開發(fā)有效治療OA的藥物具有很高的社會(huì)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。研究表明，藥物對(duì)OA的療效與OA的嚴(yán)重程度有關(guān)，故選擇合適的模型對(duì)評(píng)價(jià)藥物對(duì)OA的療效及作用機(jī)制的研究具有重要意義。采用硝普鈉誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型的方法雖有報(bào)道，但硝普鈉的劑量和誘導(dǎo)時(shí)間各不相同，且對(duì)不同濃度硝普鈉誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的比較研究較少，不利于不同嚴(yán)重程度凋亡模型的建立，進(jìn)而影響藥物對(duì)OA的療效判定及作用機(jī)制研究。本研究采用不同濃度硝普鈉誘導(dǎo)兔膝骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡，以建立不同嚴(yán)重程度的凋亡模型，為進(jìn)一步篩選治療OA藥物并評(píng)價(jià)其療效及作用機(jī)制提供理論支持。

藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、番紅-O (購自中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移的dUTP缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyltransferase-nediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL )試劑盒(購自中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)(購自中國北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 兔軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 耳緣靜脈注射空氣20 ml栓塞處死白兔，無菌條件下取白兔股骨髁和脛骨平臺(tái)表面軟骨并剪碎(體積<1 mm3)，加入10 ml 0.25%胰蛋白酶溶液于37 ℃水浴并振蕩30 min，以1 500 r/min離心5 min(離心半徑10 cm)后棄掉胰酶，加入10 ml 0.2%Ⅱ型膠原酶于37 ℃水浴并振蕩，每2 h取上清液以1 500 r/min離心5 min(離心半徑10 cm)，收集細(xì)胞，重復(fù)3次并接種于培養(yǎng)瓶中，每3 d換液1次，連續(xù)換液3次，每24 h觀察1次細(xì)胞形態(tài),連續(xù)觀察7 d。

1.4 兔軟骨細(xì)胞鑒定

1.4.1 兔軟骨細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測 兔軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)共2代，取第2代兔軟骨細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色，以1×105/ml接種于6孔板中，每孔2 ml加入經(jīng)1%(W/V)明膠處理的蓋玻片上。在含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)基，以PBS清洗，加入4%多聚甲醛溶液固定30 min。分別使用甲苯胺藍(lán)染色30 min和番紅-O染色10 min，脫水，封固，空氣干燥，倒置顯微鏡下觀察蓋玻片上的軟骨細(xì)胞并拍照。

1.4.2 兔軟骨細(xì)胞免疫熒光檢測 取第2代兔軟骨細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色，以1×105/ml接種于6孔板中，每孔2 ml加入經(jīng)1%(W/V)明膠處理的蓋玻片上。在含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后棄掉培養(yǎng)基，以PBS清洗，加入4%多聚甲醛溶液固定30 min后，過氧化氫滅活30 min。5%正常山羊血清封閉，再加入兔抗Ⅱ型膠原單克隆抗體(1∶100)，4 ℃過夜。PBS 清洗3次后加入Alexa 555標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶100)，避光37 ℃孵育1 h，DAPI復(fù)染，PBS清洗3次。以PBS代替兔抗Ⅱ型膠原單克隆抗體作為陰性對(duì)照。共聚焦顯微鏡下觀察蓋玻片上的軟骨細(xì)胞并拍照。

1.5 SNP誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞凋亡模型 取第2代兔軟骨細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色，以1×105/ml接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μl，每組各6個(gè)復(fù)孔，96孔板四周邊緣各孔加入200 μl PBS。兔軟骨細(xì)胞在含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，PBS清洗1次，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使其同步化，棄掉培養(yǎng)板中的無血清培養(yǎng)基，更換含SNP濃度為0 mmol/L、0.062 5 mmol/L、0.125 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L和2 mmol/L的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h并進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.6 模型評(píng)價(jià)

1.6.1 MTT法檢測兔軟骨細(xì)胞增殖 采用MTT法檢測兔軟骨細(xì)胞增殖。每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，置振蕩器振蕩15 min。用96孔板邊緣僅含有PBS的孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上檢測570 nm 波長處的吸光度(OD值)，重復(fù)3次取均值。

1.6.2 TUNEL法檢測兔軟骨細(xì)胞凋亡 取第2代兔軟骨細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色，以1×105/ml接種于6孔板中，每孔2 ml加入經(jīng)1%(W/V)明膠處理的蓋玻片上。在含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗1次后更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)基并加入含SNP濃度為0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L和2 mmol/L的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄掉無血清培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛溶液固定30 min，余下步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，顯微鏡下觀察并拍照，重復(fù)3次。凋亡的軟骨細(xì)胞核被染成棕黃色或褐色，正常細(xì)胞的細(xì)胞核被染成藍(lán)色。兔軟骨細(xì)胞凋亡率=(棕黃色或褐色兔軟骨細(xì)胞數(shù)/兔軟骨細(xì)胞總數(shù))×100%。

2 結(jié)果

2.1 兔軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)的兔軟骨細(xì)胞剛接種時(shí)呈小圓形，細(xì)胞大小相似，懸浮于培養(yǎng)液中，折光性強(qiáng)。培養(yǎng)8～24 h后細(xì)胞陸續(xù)貼壁，貼壁細(xì)胞輪廓清晰，呈星形(見圖1A)。第2 天細(xì)胞圓形增大，呈扁平狀并伸展為多邊形，細(xì)胞核清晰為圓形或橢圓形，可見核仁，細(xì)胞質(zhì)豐富。第3～4 天細(xì)胞聚集生長，多呈梭形，可見大多數(shù)細(xì)胞處于分裂期(見圖1B)。第5天細(xì)胞增殖明顯，緊密排列(見圖1C)。第6～7天細(xì)胞鋪滿瓶底，可見“鋪路石”樣，細(xì)胞質(zhì)回縮，分裂象少見(見圖1D)。

2.2 兔軟骨細(xì)胞鑒定 倒置顯微鏡下：番紅-O染色可見細(xì)胞被染成紅色(見圖2A)；甲苯胺藍(lán)染色可見細(xì)胞被染成藍(lán)色(見圖2B)。共聚焦顯微鏡下：Ⅱ型膠原免疫熒光染色細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜可見紅色熒光，DAPI復(fù)染后，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(見圖 2C)；陰性對(duì)照細(xì)胞核出現(xiàn)藍(lán)色熒光而細(xì)胞質(zhì)無紅色熒光(見圖2D)。

2.3 模型評(píng)價(jià)

2.3.1 兔軟骨細(xì)胞增殖檢測 不同濃度SNP誘導(dǎo)下兔軟骨細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SNP濃度為0.062 5、0.125 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時(shí)兔軟骨細(xì)胞OD值高于SNP濃度為0 mmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時(shí)兔軟骨細(xì)胞OD值均低于SNP濃度為0 mmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時(shí)兔軟骨細(xì)胞OD值在不同濃度間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

注：A為第1天，B為第3天，C為第5天，D為第7天

圖1 倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞形態(tài)(×200)

Figure 1 The morphology of primary rabbit chondrocytes with inverted microscope

注：A為番紅-O染色，B為甲苯胺藍(lán)染色，C為Ⅱ型膠原免疫熒光染色，D為Ⅱ型膠原免疫熒光染色陰性對(duì)照

圖2 倒置顯微鏡和共聚焦顯微鏡下第2代兔軟骨細(xì)胞鑒定(×200)

Figure 2 The identification of rabbit chondrocytes of passage two with inverted microscope and confocal microscope

Table 1 Comparison of OD value of rabbit chondrocytes induced by different concentrations of SNP at different times

SNP濃度(mmol/L)12h24h48h00.71±0.020.86±0.020.95±0.060.06250.79±0.05a1.11±0.04a1.13±0.05a0.1250.81±0.02a1.12±0.05a1.15±0.03a0.250.63±0.03ab0.57±0.02ab0.48±0.03ab0.50.56±0.01abc0.46±0.02abc0.29±0.02abc10.33±0.01abcd0.19±0.03abcd0.14±0.01abcd20.20±0.02abcde0.07±0.02abcde0.05±0.01abcdeF值85.57227.40182.60P值<0.05<0.05<0.05

注：SNP=硝普鈉；與SNP濃度為0 mmol/L比較，aP<0.05；與SNP濃度為0.125 mmol/L比較，bP<0.05；與SNP濃度為0.25 mmol/L比較，cP<0.05；與SNP濃度為0.5 mmol/L比較，dP<0.05；與SNP濃度為1 mmol/L比較，eP<0.05

2.3.2 兔軟骨凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 SNP濃度為0 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞排列緊密，輪廓清晰可見。12 h時(shí)，SNP濃度為0.25 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞偶見

凋亡小體出現(xiàn)，SNP濃度為0.5、1、2 mmol/L 時(shí)，隨著濃度的增加兔軟骨細(xì)胞受損程度越嚴(yán)重并可見細(xì)胞排列稀疏、皺縮明顯、凋亡小體大量出現(xiàn)甚至大片細(xì)胞脫落(見圖3A～E)；24 h時(shí)細(xì)胞較12 h細(xì)胞損傷程度嚴(yán)重，在SNP濃度為0.25 mmol/L時(shí)便可見細(xì)胞脫落，凋亡小體較多出現(xiàn)(見圖3F～J)；48 h時(shí)細(xì)胞形態(tài)較12、24 h體積明顯減小，細(xì)胞從SNP濃度為0.5 mmol/L時(shí)開始脫落(見圖3K～Q)。

2.3.3 兔軟骨細(xì)胞凋亡檢測 TUNEL染色結(jié)果表明，SNP濃度為0 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞細(xì)胞核被染成藍(lán)色(見圖4A、F、K)。SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)棕色和褐色，且隨著濃度和時(shí)間的增加，棕色細(xì)胞核數(shù)目也隨之增加(見圖4B～E、G～J、L～O)。不同濃度SNP誘導(dǎo)下兔軟骨細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的凋亡率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時(shí)兔軟骨細(xì)胞凋亡率均高于SNP濃度為0 mmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且不同濃度間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

注：A～E為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12 h時(shí)兔軟骨細(xì)胞形態(tài)變化，F(xiàn)～J為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)24 h時(shí)兔軟骨細(xì)胞形態(tài)變化，K～Q為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)48 h時(shí)兔軟骨細(xì)胞形態(tài)變化

圖3 倒置顯微鏡下兔軟骨凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×200)

Figure 3 The morphological observation of apoptotic cells of rabbit chondrocytes with inverted microscope

注：A～E為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12 h時(shí)TUNEL染色，F(xiàn)～J為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)24 h時(shí)TUNEL染色，K～Q為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)48 h時(shí)TUNEL染色

圖4 兔軟骨細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×200)

Figure 4 The apoptosis of chondrocyte

Table 2 Comparison of apoptosis rate of chondrocytes induced by different concentration of SNP at different times

SNP濃度(mmol/L)12h24h48h01.55±0.342.35±0.293.50±1.300.2514.50±1.42a31.88±1.23a47.95±2.37a0.532.50±1.58ab51.88±2.07ab90.57±2.02ab174.33±2.40abc84.21±2.75abc94.93±0.95abc285.63±1.82abcd95.18±2.01abcd96.08±1.40abcdF值347.52294.17344.59P值<0.05<0.05<0.05

注：與SNP濃度為0 mmol/L比較，aP<0.05；與SNP濃度為0.25 mmol/L比較，bP<0.05；與SNP濃度為0.5 mmol/L比較，cP<0.05；與SNP濃度為1 mmol/L比較，dP<0.05

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)，藥物對(duì)OA的療效與OA的嚴(yán)重程度有關(guān)[8-9]。因此，建立合適的模型對(duì)于篩選潛在治療OA的藥物具有重要意義。采用SNP誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞凋亡模型雖有多項(xiàng)報(bào)道，但SNP濃度和作用時(shí)間各異，不利于有針對(duì)性地篩選治療OA的藥物及評(píng)價(jià)療效。Eo等[10]采用SNP濃度為1 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞24 h，Todd Allen等[11]采用SNP濃度為0.5 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞16 h，Wu等[12]采用SNP 濃度為2 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞24 h，Terauchi等[13]和Tonomura等[14]采用SNP濃度為 0.5 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞12 h和10 h建立兔軟骨細(xì)胞凋亡模型。本研究通過不同濃度SNP、作用不同時(shí)間來考察SNP對(duì)兔軟骨細(xì)胞凋亡的影響，采用MTT法在倒置顯微鏡下觀察兔軟骨凋亡細(xì)胞形態(tài)變化，TUNEL法評(píng)價(jià)與比較了不同濃度SNP誘導(dǎo)不同嚴(yán)重程度的軟骨細(xì)胞凋亡模型。

有研究表明，低濃度SNP(0.1 mmol/L)可激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，高濃度SNP(0.5～2 mmol/L)可通過激活p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡[5,15-16]。因此，在采用SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡時(shí)應(yīng)篩選出可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的SNP濃度范圍。本研究分別采用SNP濃度為0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞，以建立不同嚴(yán)重程度的兔軟骨細(xì)胞凋亡模型。體外培養(yǎng)兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞并鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞可分泌糖胺聚糖以及Ⅱ型膠原等兔軟骨細(xì)胞特異性成分，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為兔軟骨細(xì)胞后，采用MTT法及TUNEL法比較了不同濃度SNP作用不同時(shí)間對(duì)兔軟骨細(xì)胞凋亡的影響。本研究結(jié)果顯示，SNP濃度為0.062 5、0.125 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時(shí)兔軟骨細(xì)胞OD值高于SNP濃度為0 mmol/L，SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時(shí)兔軟骨細(xì)胞OD值均低于SNP濃度為0 mmol/L，SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時(shí)兔軟骨細(xì)胞OD值在不同濃度間兩兩比較有差異。提示SNP濃度為0.062 5、0.125 mmol/L時(shí)可促進(jìn)兔軟骨細(xì)胞增殖，SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L時(shí)可抑制兔軟骨細(xì)胞增殖，能夠制備不同嚴(yán)重程度的兔軟骨細(xì)胞凋亡模型，且隨著濃度的增加對(duì)兔軟骨細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)。

本研究結(jié)果顯示，SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時(shí)兔軟骨細(xì)胞凋亡率均高于SNP濃度為0 mmol/L，且不同濃度間兔軟骨細(xì)胞凋亡率比較有差異，提示隨著SNP濃度的增加兔軟骨細(xì)胞凋亡率增加。本研究結(jié)果還顯示，建立凋亡率為10%～20%兔軟骨細(xì)胞凋亡模型，可采用SNP濃度為0.25 mmol/L培養(yǎng)12 h；建立凋亡率為30%～60%兔軟骨細(xì)胞凋亡模型，可采用SNP濃度為0.25 mmol/L培養(yǎng)24 h和48 h以及SNP濃度為0.5 mmol/L培養(yǎng)12 h和24 h；建立凋亡率為70%～90%兔軟骨細(xì)胞凋亡模型，可采用SNP濃度為0.5 mmol/L培養(yǎng)48 h以及SNP濃度為1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24和48 h。此外，在TUNEL實(shí)驗(yàn)過程中，可采用1%明膠包被的蓋玻片來制備細(xì)胞玻片，可較好地防止細(xì)胞在后續(xù)處理過程中脫落。此外，還可適當(dāng)增加聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)破膜的時(shí)間，本研究采用1% Triton X-100 通透軟骨細(xì)胞7 min效果較好。研究中也可配制含0.1% Triton X-100的PBS作為洗液并適當(dāng)增加洗滌次數(shù)和時(shí)間，可有效防止雜質(zhì)對(duì)研究結(jié)果的影響[17]。

綜上所述，本研究利用SNP誘導(dǎo)建立軟骨細(xì)胞凋亡模型，比較了不同嚴(yán)重程度的凋亡模型，為篩選潛在治療不同嚴(yán)重程度OA的藥物提供合適的模型，便于進(jìn)一步判定和探討藥物對(duì)OA的療效及藥物降低OA導(dǎo)致疼痛機(jī)制的研究。但本研究僅針對(duì)家兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行考察，其他種屬來源的膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞尚未進(jìn)行研究，而不同種屬間存在一定差異，故仍需在今后進(jìn)行深入探討。

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(本文編輯：李婷婷)

Rabbit Chondrocytes Apoptosis Models Induced by Different Concentrations of SNP

CHENQi-xin,HANGuan-ying,GUOBin，etal.

CollegeofPharmacy,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001,China

Objective To compare the chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of sodium nitroprusside (SNP),in order to provide theoretical support for the further investigation of the regulating effect of drugs on chondrocytes apoptosis.Methods Eight 4-week-old healthy New Zealand male rabbits (weight,200-250 g) were selected from September to December in 2014.Rabbit chondrocytes were cultured and researched in vitro.Different concentrations of SNP (0.062 5,0.125,0.25,0.5,1,2 mmol/L) were used to induce rabbit chondrocytes.At 12,24 and 48 h,MTT method and TUNEL method were employed to evaluate the chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of SNP.The OD value and apoptosis rate of rabbit chondrocytes were recorded.Results At different time points,chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of SNP were significantly different (P<0.05) in OD value.At 12,24 and 48 h,chondrocytes apoptosis models induced by 0.062 5 mmol/L and 0.125 mmol/L of SNP were higher (P<0.05) than the chondrocytes apoptosis model induced by 0 mmol/L of SNP in OD value;at 12,24 and 48 h,chondrocytes apoptosis models induced by 0.25，0.5，1 and 2 mmol/L of SNP were lower (P<0.05) than the chondrocytes apoptosis model induced by 0 mmol/L of SNP in OD value;at 12,24 and 48 h,chondrocytes apoptosis models induced by 0.25，0.5，1 and 2 mmol/L of SNP were significantly different (P<0.05) in OD value.At different time points,chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of SNP were significantly different (P<0.05) in apoptosis rate.At 12,24 and 48 h,chondrocytes apoptosis models induced by 0.25，0.5，1 and 2 mmol/L of SNP were higher (P<0.05) than the chondrocytes apoptosis model induced by 0 mmol/L of SNP in apoptosis rate;chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of SNP were significantly different (P<0.05) in apoptosis rate.Conclusion Chondrocytes apoptosis models of different severity degrees can be build by SNP with the concentration ranging from 0.25 mmol/L to 2 mmol/L,which provides theoretical support for the regulating effect of drugs on chondrocytes apoptosis.

Nitroprusside；Chondrocytes；Apoptosis

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81302681)；國家“十二五”重大新藥創(chuàng)制基金(2012ZX093016-002)；遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013022051)；遼寧醫(yī)學(xué)院校長基金-奧鴻博澤基金(XZJJ20130106-02)；遼寧醫(yī)學(xué)院校長基金-全民口腔研究生科研創(chuàng)新基金(QM2014007)

121001遼寧省錦州市，遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院(陳啟鑫)；遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院(韓冠英，郭斌)；中國科學(xué)院上海藥物研究所(韓冠英，郭躍偉)

韓冠英，121001 遼寧省錦州市，遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，中國科學(xué)院上海藥物研究所；E-mail:hgy19800223@163.com

R 963

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.24.y01

2015-02-21；

2015-06-13)