趙云紅　趙　敏　張　強　郝　芳

云南省腫瘤醫(yī)院昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院　650106

論著

S100A4和HIF-1α與卵巢漿液性囊腺癌預后的關系研究

趙云紅趙敏張強郝芳

云南省腫瘤醫(yī)院昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院650106

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，由于起病隱匿，缺乏早期特異性癥狀和早期有效的診斷篩查方法，85%病例在晚期才得以診斷，而5年生存率僅15%[1]，目前標準的治療方案是腫瘤細胞減滅術以及以鉑類為基礎聯(lián)合化療，然而70%的晚期患者最終將復發(fā)轉移，耐藥是導致其化療失敗的主要原因。S100A4是鈣離子結合蛋白，通過鈣離子信號轉導調節(jié)細胞周期調控、細胞黏附和運動、細胞增殖分化、基因表達、酶的激活及細胞凋亡[2]。目前研究證實S100A4 可在多種惡性腫瘤中高表達，且與浸潤轉移及預后密切相關。HIF-1α是介導哺乳動物和人類細胞缺氧反應的核轉錄因子[3]，在低氧環(huán)境下HIF-1α可以激活產生多種靶基因產物，促進腫瘤血管生成、能量代謝、腫瘤侵襲和轉移、腫瘤生存和增殖、放化療耐受性、免疫逃逸等[4]；本研究檢測卵巢漿液性囊腺癌中S100A4與HIF-1α的表達情況，旨在進一步探討S100A4和HIF-1α與卵巢漿液性囊腺癌鉑類化療耐藥和生存期的關系。

1資料與方法

1.1一般資料收集2007-2010年期間在我院首次手術并確診的卵巢漿液性囊腺癌初治患者50例，同時收集卵巢漿液性囊腺瘤28例和正常卵巢組織15例(因子宮肌瘤行子宮、雙附件/單側附件切除術患者)作為對照。所有卵巢漿液性囊腺癌病例術后均予鉑類為基礎的多藥聯(lián)合化療，主要化療方案為PC和TC方案，給藥途徑為靜脈化療和腹腔化療，療程為4～10個不等。參照2010年版NCCN卵巢癌臨床實踐指南對鉑類耐藥和鉑類敏感的定義，50例患者中28例為鉑耐藥患者(22/28,78.6%)，22例為鉑敏感患者(10/22,45.5%)。50例卵巢漿液性囊腺癌患者均以電話或來院復查方式進行隨訪，隨訪截止時間為2014年4月。試劑：(1)S100A4濃縮型兔抗人單克隆抗體購于美國Epitomics公司。(2)HIF-1α濃縮型鼠抗人單克隆抗體購于Merck Millipore公司。PBS緩沖液、抗原修復液、DAB顯色劑購于福建邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學法。所有組織標本均經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，制備4μm厚切片，恒溫箱60℃內烤片過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3%H2O2溶液室溫下孵育10min，微波抗原修復15min，正常山羊血清封閉30min、一抗(工作濃度S100A4 1∶1 000；HIF-1α 1∶100) 4℃孵育過夜, 37℃復溫45min后加即用型二抗工作液，室溫下孵育15min，DAB顯色、自來水沖洗，蘇木素復染1~1.5min，0.1%鹽酸酒精分化，PBS返藍10~15min。常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。S100A4用已知扁桃體S100A4陽性標本作為陽性對照；HIF-1α用已知乳腺癌HIF-1α陽性標本作為陽性對照，用PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.2.2評分方法。采用綜合計分法[5]，無色為0分，著色弱但明顯強于陰性對照者為1分，染色清晰者為2分，強染色為3分。陽性細胞率即陽性細胞占計數(shù)細胞的比例，以隨機計數(shù)10個高倍視野細胞為準：陽性細胞<5%為0分，5%~25%為1分，26%~50%為2分，51%~75%為3分，>75%為4分。兩項乘積1~2分為陰性，3分及以上為陽性，無論染色強度如何，細胞陽性率<10%為陰性。

2結果

2.1S100A4和HIF-1α蛋白的表達S100A4在卵巢漿液性囊腺癌組織和部分卵巢漿液性囊腺瘤組織中呈胞核和/或胞漿著淺黃色至棕黃色顆粒表達；HIF-1α在卵巢漿液性囊腺癌組織中呈胞核和/或胞漿著淺黃色至棕黃色顆粒表達，見圖1、2和表1。

圖1　S100A4蛋白陽性表達(×400)

圖2　HIF-1α蛋白陽性表達(×400)

組別nS100A4蛋白表達陽性陰性陽性表達率(%)HIF-1α蛋白表達陽性陰性陽性表達率(%)卵巢漿液性囊腺癌5041982.0△▲321864△▲卵巢漿液性囊腺瘤2832510.7#0280 正常卵巢1501500150

注：良性與正常組比較,#P>0.05；惡性與正常組比較,△P<0.001；惡性與良性組比較,▲P<0.001。

2.2S100A4和HIF-1α蛋白表達的相關性卵巢漿液性囊腺癌中的S100A4蛋白表達與HIF-1α蛋白表達進行配對卡方檢驗(χ2=8.315，P=0.004)(見表2)，兩種蛋白表達存在關聯(lián)性。進一步Spearman相關性分析(r=0.408，P=0.003)，說明兩種蛋白表達存在顯著正相關性。

表2　S100A4蛋白表達與HIF-1α蛋白表達的相關性分析

2.3S100A4和HIF-1α與卵巢漿液性囊腺癌鉑化療耐藥和生存時間的關系鉑類化療耐藥組中S100A4陽性表達率為89.29%(25/28)，與敏感組(72.73%，16/22)，差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)；鉑類化療耐藥組中HIF-1α陽性表達率為78.57%(22/28)，與敏感組(45.45%，10/22)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。S100A4與HIF-1α聯(lián)合表達在鉑化療耐藥中P<0.005,差異有統(tǒng)計學意義(見表3)。

2.4S100A4蛋白與HIF-1α蛋白的表達與患者生存期的關系S100A4蛋白和HIF-1α蛋白陽性表達患者的生存時間較陰性者明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3、4。

圖3S100A4蛋白表達與生存時間的關系

圖4　HIF-1α蛋白表達與生存時間的關系

3討論

S100A4是鈣離子結合蛋白S100家族的24個成員之一[2]，分子量為 11.5KD，由101個氨基酸組成的多肽。編碼基因定位于1q21，該區(qū)穩(wěn)定性差，易發(fā)生各種染色體的缺失、易位、重疊等改變。近年研究發(fā)現(xiàn)，S100A4蛋白參與了細胞異常增生、細胞惡變、瘤細胞的運動性增強、細胞間黏附力降低、浸潤力增強、促新生血管生長等過程，與惡性腫瘤的侵襲和轉移有著密不可分的聯(lián)系[6]。 S100A4 可在多種惡性腫瘤中高表達。本研究中，S100A4蛋白在卵巢漿液性囊腺瘤組織標本中低表達，正常卵巢組織標本中無表達，而在卵巢漿液性囊腺癌組織中呈高表達，提示S100A4 蛋白可能參與了卵巢漿液性囊腺癌發(fā)生發(fā)展過程。Chen等[7]siRNA沉默S100A4基因在食管鱗癌細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)癌細胞侵襲轉移能力明顯降低。Mencia等[8]研究證實，S100A4在甲氨蝶呤耐藥細胞系中高表達，與結腸癌甲氨蝶呤化療敏感度相關。本研究發(fā)現(xiàn)鉑類化療耐藥患者中S100A4陽性表達率與敏感患者的陽性率差異無統(tǒng)計學意義，但聯(lián)合HIF-1α表達后與患者的化療耐藥顯著相關，這可能與本研究病例偏少有關，有待擴大病例進一步研究。同時， S100A4低表達的患者生存期較高表達者明顯延長，差異具有統(tǒng)計學意義。

缺氧誘導因子-1(Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是介導哺乳動物和人類細胞缺氧反應的核轉錄因子[9]由α和β亞單位組成， HIF-1α是缺氧調節(jié)的功能亞單位[10]。腫瘤細胞的無限增殖常常使腫瘤處于缺氧狀態(tài)，低氧是惡性腫瘤存在的一個重要的微環(huán)境。近年研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α參與了促進多種腫瘤生長[11]、血管生成和侵襲轉移的過程[12]。本研究結果顯示，HIF-1α在卵巢漿液性囊腺癌組織標本中高表達，與正常卵巢組織和卵巢漿液性囊腺瘤組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。聶春蓮等[13]研究發(fā)現(xiàn)，下調 HIF-1α的表達，結果癌細胞對化療藥物敏感性顯著增高。本研究發(fā)現(xiàn)化療耐藥者HIF-1α的表達明顯高于敏感者(P<0.05)，低表達HIF-1α的患者生存期較高表達者明顯延長，差異具有統(tǒng)計學意義。

Horiuchi等[14]研究發(fā)現(xiàn)缺氧能夠誘導S100A4的表達， S100A4被siRNA抑制后，缺氧條件下，S100A4表達增加，并且侵襲力也增加。S100A4和HIF-1α之間可能存在著某種相互作用的機制，本研究發(fā)現(xiàn)，S100A4和HIF-1α的表達不僅呈明顯正相關(r=0.408，P=0.003)，并且兩因子的聯(lián)合表達與卵巢漿液性囊腺癌患者的鉑化療耐藥有關(P<0.05)。提示S100A4與HIF-1α高表達可能是卵巢漿液性囊腺癌發(fā)生和進展過程中的重要分子事件，可能是影響卵巢漿液性囊腺癌的鉑化療耐藥重要因素。

綜上所述，S100A4和HIF-1α有望作為一個分子指標，對預測腫瘤鉑化療藥物敏感度和判斷預后具有一定的臨床指導價值。

參考文獻

[1]Jemal A，Siegel R，Xu J，etal.Cancer statistics，2010〔J〕.CA Cancer J Clin，2010，60(5)：277-300.

[2]Donato R,Cannon BR,Sorci G,etal.Functions of s100 proteins〔J〕.Curr Mol Med,2013,13(1):24-57.

[3]Semenza GL,Wang GL.A nuclear factor induced by hypoxia via denovo protein synthesis binds to the human gene enhancer at a site repaired for transcriptional activation〔J〕.Mol Cell Bio,2002,12(12):5447-5454．

[4]Samoǐlenko AA．The role of hypoxia-inducible factor family(HIF) proteins in the regulation of cells physiologic responses to hypoxia 〔J〕．Ukr Biokhim Zh，2010，82(4):5-17．

[5]Fromowitz FB, Viola MV，etal.Ras P21 expression in the Progression of breast cancer〔J〕.Hum Pathol,1987,18(l):1268.

[6]Yao R, Davidson DD, Lopez-Beltran A,etal.The S100 proteins for screening and prognostic grading of bladder cancer 〔J〕. Histol Histopathol, 2007,22(9):1025-1032.

[7]Chen D, Zheng XF, Yang ZY,etal.S100A4 silencing blocks invasive ability of esophageal squamous cell carcinoma cells〔J〕. World J Gastroenterol，2012,18(9):915-922.

[8]Mencia N,Selga E,Rico I,etal.Overexpression of S100A4 in human cancer cell lines resistant to methotrexate〔J〕．BMC Cancer,2010,10:250

[9]Semenza GL,Wang GL.A nuclear factor induced by hypoxia via denovo protein synthesis binds to the human gene enhancer at a site repaired for transcriptional activation〔J〕.Mol Cell Bio,2002,12(12):5447-5454．

[10]Schumacker PT.Hypoxia-inducible factor-1(HIF-1)〔J〕.Crit Care Med,2005,33(12 Sl):423-425.

[11]Kuphal S, Winklmeier A, Watnecke C,etal.Constitutive HIF-1 activity in malignant melanoma〔J〕. Eur J Cancer,2010,46(6):1159-1169.

[12]Semenza GL.Defining the Role of Hypoxia-inducible factor 1 in cancer biology and therapeutics〔J〕. Oncol Gene,2010,29(5):625-634.

[13]聶春蓮, 高國蘭. 低氧誘導因子-1αRNAi 表達質粒對卵巢癌細胞影響的實驗研究〔J〕.中國腫瘤臨床, 2011, 28(9):485-487.

[14]Horiuchi A,Hayashi T,Kikuchi N,etal.Hypoxia upregulates ovarian cancer invasiveness via the binding of HIF-1alpha to a hypoxia-induced, methylation-free hypoxia response element of S100A4 gene〔J〕.Int J Cancer,2012,131(8):1755-1767.

(編輯落落)

摘要目的：探討S100A4和HIF-1α與卵巢漿液性囊腺癌預后的關系。方法：收集50例卵巢漿液性囊腺癌，28例卵巢漿液性囊腺瘤和15例正常卵巢組織為對照，采用免疫組織化學法檢測S100A4和HIF-1α的表達，并分析與患者預后的關系。結果：S100A4和HIF-1α在卵巢漿液性囊腺癌組織中高表達，而在卵巢漿液性囊腺瘤組和正常卵巢組中低表達或不表達。S100A4與HIF-1α表達呈顯著正相關性。S100A4與鉑化療耐藥無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，HIF-1α與鉑化療耐藥有密切關系(P<0.05)。 S100A4和HIF-1α同時表達與鉑化療耐藥密切相關(P<0.05)；同時S100A4和HIF-1α陽性表達患者的生存時間較陰性者明顯減少(P<0.05)。結論：S100A4和HIF-1α的表達促進卵巢漿液性囊腺癌的發(fā)生發(fā)展，并且與患者鉑化療耐藥和生存時間相關。

關鍵詞卵巢漿液性囊腺癌S100A4HIF-1α免疫組化

Expression and Clinical Significance of S100A4 and HIF-1α Protein in Ovarian Serous Cystadenocarcinoma

ZHAO Yunhong, ZHAO Ming,ZHANG Qiang，etal.TheThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,KunmingCity,YunnanProvince650106

ABSTRACTObjective:To study the expression of S100A4 and HIF-1α protein in Ovarian Serous Cystadenocarcinoma，analyzed the relationship between the two proteins.Methods:Immunohistochemistry method was used to detect S100A4 and HIF-1α proteins expression and analysis the correlation of proteins expression in Ovarian Serous Cystadenocarcinoma.Results:S100A4 and HIF-1α in Ovarian Serous Cystadenocarcinoma showed a high expression. S100A4 protein expression in Ovarian Serous carcinoma was positive relation with HIF-1α protein expression.The expression of S100A4 and HIF-1α protein existed intimate relation with cisplatin-based chemotherapy resistance (P<0.05).They are associated with overall survival,longer the overall survival,lower the expression (P<0.05).Conclusion:Expression of S100A4 and HIF-1α existed significant positive correlation.High S100A4 and HIF-1α expression predicts cisplatin-based chemotherapy resistance and the overall survival in Ovarian Serous Cystadenocarcinoma.

KEY WORDSOvarian Serous Cystadenocarcinoma，S100A4 and HIF-1α，Immunohistochemistry, Chemotherapy resistance

收稿日期2014-10-11

中圖分類號：R737.31

文獻標識碼：A

文章編號：1001-7585(2015)01-0015-04