趙　成, 張　璐, 王　紅, 劉布駿

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科, 江蘇 南京, 210008)

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型的療效觀察

趙成, 張璐, 王紅, 劉布駿

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科, 江蘇 南京, 210008)

摘要:目的探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSCs)移植治療大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)模型的療效。方法40只造模成功的Wistar大鼠隨機(jī)分為MSCs移植治療組(MSC組，n=20)、細(xì)胞對(duì)照組(FLS組，n=10)、疾病對(duì)照組(CIA組，n=10)，10只正常的Wistar大鼠作為正常對(duì)照組。采用AI評(píng)分來(lái)評(píng)價(jià)CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度。第17天予MSC組CIA大鼠尾靜脈注射1×106UCMSCs，F(xiàn)LSs組CIA大鼠尾靜脈注射等量成纖維樣滑膜細(xì)胞。第42天處死所有大鼠，外周血分離血清，踝關(guān)節(jié)HE染色。ELISA法檢測(cè)血清中TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-6水平。踝關(guān)節(jié)病理評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)間隙狹窄程度。結(jié)果MSC組大鼠關(guān)節(jié)AI低于FLS組和CIA組(P<0.05); HE染色示CIA大鼠造模后踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及關(guān)節(jié)腔狹窄，但MSC治療組關(guān)節(jié)間隙明顯好于CIA組和FLS組; CIA組和FLS組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于正常對(duì)照組，MSC治療組TNF-α、IL-1β、IL-6水平較CIA組和FLS組均有顯著下降(P<0.05); TGF-β在對(duì)照組與CIA組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但輸注MSC后TGF-β得到上調(diào)(P<0.01)。結(jié)論UCMSCs移植能通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6, 上調(diào)抑炎細(xì)胞因子TGF-β來(lái)減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥和軟骨破壞。

關(guān)鍵詞:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎; 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞; 膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以慢性滑膜增殖和進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞為特征的全身性自身免疫病，中國(guó)RA患病率為0.34%，患病人數(shù)達(dá)500萬(wàn)，嚴(yán)重危害人們的身體健康。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSCs)是來(lái)源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞。UCMSCs體外容易擴(kuò)增，安全性較好，低免疫原性，且具有強(qiáng)大的免疫抑制功能，因此成為自身免疫病細(xì)胞治療的首選細(xì)胞。有研究者[1-2]證實(shí)MSCs能抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLSs)活化和增殖，從而改善關(guān)節(jié)炎癥。本科對(duì)少數(shù)難治性RA患者試用了異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療，取得了一定的療效[3]。本研究探討UCMSCs對(duì)于膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)模型的治療作用，為臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用異基因UCMSCs移植治療RA提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

50只Wistar大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司, 6～8周齡，在無(wú)菌層流環(huán)境中飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)。飼料、飲水和墊料均經(jīng)高壓滅菌處理。臍帶標(biāo)本取自南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院產(chǎn)科，2名順產(chǎn)婦分娩后無(wú)菌剪取臍帶組織?；?biāo)本取自南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院關(guān)節(jié)外科骨關(guān)節(jié)炎行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者，共5例，其中男2例，女3例，年齡47～65歲，平均(56.80±7.16)歲，病程4～13年，平均(8.00±3.39)年。

1.2　主要試劑和儀器

DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25%胰酶購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛Ⅱ型膠原、Ⅰ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Sigma Alorich公司。大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β ELISA試劑盒，鼠抗人異硫氰酸熒光素(FITC)-CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、HLA-G單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)BioTek公司。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1UCMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定：無(wú)菌條件下取臍帶組織標(biāo)本，剔除血管，撕取華通膠組織，剪至1 mm×1 mm×1 mm大小，加入少量10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)液，每7 d更換一半培養(yǎng)液，第20天待培養(yǎng)瓶底爬出細(xì)胞，胰蛋白酶/EDTA 溶液消化細(xì)胞，按1∶3傳代，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第3代，經(jīng)消化重懸制成1×105/mL的單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、HLA-G等表面標(biāo)記。

1.3.2FLSs分離培養(yǎng)：無(wú)菌條件下將滑膜組織標(biāo)本銳性剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm大小，加入2～3倍體積比1 mg/mL Ⅰ型膠原酶，避光于37 ℃搖動(dòng)中消化4 h。經(jīng)200目細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾組織塊后, 1 000 r/min離心5 min, 去上清，加入適量10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)液 ，吹打混勻后，于5% CO237 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每3～4 d更換培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋底面>80%時(shí)，棄培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶/EDTA 溶液覆蓋底面。顯微鏡下觀察至大部分細(xì)胞變圓后終止消化, 1 000 r/min離心5 min, 棄上清，加入適量培養(yǎng)液吹打混勻后，按1∶3傳代。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第3代，經(jīng)消化重懸制成1×105/mL的單細(xì)胞懸液。

1.3.3CIA大鼠模型建立：無(wú)菌條件下，用0.05 mol/L冰醋酸充分溶解牛Ⅱ型膠原(CⅡ), 質(zhì)量濃度為4 mg/mL。置4 ℃冰箱過(guò)夜后，與弗氏佐劑(CFA)等體積混合，振蕩乳化，取乳化液滴入水中不擴(kuò)散表示乳化充分，制成CⅡ乳劑(CⅡ終濃度為2 mg/mL)。乳化全程冰浴中操作。于雌性Wistar大鼠尾根部、背部?jī)牲c(diǎn)皮內(nèi)注射，總量100 μL。2周后同法100 μL加強(qiáng)注射。

1.3.4關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)評(píng)分：采用AI評(píng)分法進(jìn)行大鼠關(guān)節(jié)足腫脹評(píng)價(jià)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無(wú)關(guān)節(jié)腫脹; 1分，小趾關(guān)節(jié)稍紅腫; 2分，趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹; 3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹，嚴(yán)重紅腫; 4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)全部足爪嚴(yán)重紅腫，關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙。四肢的病變程度累積積分為AI，每只大鼠的最高分為16分。每3 d評(píng)價(jià)1次。

1.3.5大鼠分組處理：第0天予以皮內(nèi)注射CII乳劑和弗氏完全佐劑混合液，第14天皮內(nèi)注射CII乳劑和弗氏不完全佐劑混合液，第17天給予20只CIA大鼠尾靜脈注射1×106UCMSCs(MSC組), 10只CIA大鼠尾靜脈注射等量FLSs作為細(xì)胞對(duì)照組(FLS組), 10只CIA大鼠為疾病對(duì)照組(CIA組), 10只正常Wistar大鼠為正常對(duì)照組。第42天處死所有大鼠，外周血分離血清，踝關(guān)節(jié)HE染色。

1.3.6ELISA檢測(cè)大鼠血清中細(xì)胞因子：大鼠處死前內(nèi)眥靜脈取外周血2 mL, 1 000 r/min離心10 min, 吸取上清，按ELISA試劑盒指示檢測(cè)血清中TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-6水平。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用GraphPad Prism5軟件作圖，多個(gè)樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　UCMSCs鑒定

通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)第3代UCMSCs表面標(biāo)記物檢測(cè)，結(jié)果示CD29、CD44、CD73和CD90陽(yáng)性，HLA-G、CD14、CD34和CD45陰性，符合MSCs特征(圖1)。

圖1 UCMSCs表面標(biāo)記物

2.2　各組CIA大鼠病情比較

CIA組關(guān)節(jié)腫脹明顯，MSC治療組關(guān)節(jié)腫脹程度低于CIA組和FLS組(圖2)；MSC組大鼠關(guān)節(jié)AI低于FLS組和CIA組(P<0.05)(圖3); HE染色示CIA大鼠造模后踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及關(guān)節(jié)腔狹窄，但MSC治療組關(guān)節(jié)間隙明顯好于CIA組和FLS組(圖4)。

圖2 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度比較

圖3 各組大鼠關(guān)節(jié)AI比較

圖4 各組大鼠關(guān)節(jié)病理檢查結(jié)果比較 HE染色

2.3　大鼠外周血細(xì)胞因子水平

大鼠各組血清細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β平均值見(jiàn)表1。CIA組和FLS組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于正常對(duì)照組，UCMSC治療組TNF-α、IL-1β、IL-6水平較CIA組和FLS組均有顯著下降(P<0.05)。MSC治療組炎性細(xì)胞因子水平有顯著下調(diào)，而FLSs則不能發(fā)揮下調(diào)作用。盡管抑炎性細(xì)胞因子TGF-β在正常與疾病鼠間無(wú)顯著差異，但輸注MSC后TGF-β得到上調(diào)(P<0.01)。

3討論

RA的主要病變?cè)陉P(guān)節(jié)，在關(guān)節(jié)內(nèi)可以看到滑膜組織異常增生、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及軟骨和骨進(jìn)行性破壞。目前RA治療多采用甲氨蝶呤、來(lái)氟米特等慢作用藥物，近年來(lái)生物制劑如TNF-α拮抗劑的應(yīng)用提高了臨床緩解率，使更多的患者受益。盡管諸多藥物的應(yīng)用和推廣，臨床上仍有部分患者病情難以控制，因此尋找新的治療方法至關(guān)重要。MSCs可從骨髓、外周血、臍血、臍帶、牙髓、脂肪組織等多種組織中分離。MSCs不表達(dá)HLA-DR和協(xié)同刺激分子CD80、CD86, 低表達(dá)MHC-I類分子，免疫原性低，移植治療不會(huì)導(dǎo)致排斥反應(yīng)，具有較好的安全性[4-5]。相比于其他來(lái)源的MSCs, UCMSCs表達(dá)多種胚胎干細(xì)胞的特有分子標(biāo)志，具有分化潛力大、增殖能力強(qiáng)、取材方便等特征。體內(nèi)和體外研究證實(shí), UCMSCs具有免疫抑制能力，且該能力主要通過(guò)分泌可溶性細(xì)胞因子或細(xì)胞間直接接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)[6-7]。因此成為具有臨床應(yīng)用前景的多能干細(xì)胞[8]。既往研究[9-10]發(fā)現(xiàn), UCMSCs能通過(guò)調(diào)節(jié)患者體內(nèi)失衡的淋巴細(xì)胞亞群，從而有效改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡、克羅恩病等多種自身免疫病。

表1　各組大鼠細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β水平比較　pg/mL

TNF-α是RA發(fā)病機(jī)制中居中心地位的促炎癥性細(xì)胞因子，參與RA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。TNF-α通過(guò)活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和MAPK途徑上調(diào)多種致炎細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子和生長(zhǎng)因子表達(dá)；促進(jìn)血管翳的形成，并抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能[11]; TNF-α還可促使滑膜成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、IL-8及TNF-α本身而加重組織損傷[12]; TNF-α還可直接誘導(dǎo)關(guān)節(jié)疼痛[13]。目前抗TNF-α治療已廣泛應(yīng)用于RA臨床治療，取得了顯著療效。IL-1主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，它能促進(jìn)滑膜細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)滑膜細(xì)胞合成并釋放前列腺素E2(PGE2)和膠原酶。PGE2和膠原酶引發(fā)滑膜炎癥反應(yīng)、軟骨基質(zhì)的崩解，而局部免疫復(fù)合物、游離的膠原等分解產(chǎn)物又可刺激IL-1的合成[14]。另外，IL-1能刺激滑膜細(xì)胞合成過(guò)量基質(zhì)金屬蛋白酶，包括膠原酶和基質(zhì)溶素，后者能溶解破壞軟骨基質(zhì)[15]。因此, IL-1是破壞關(guān)節(jié)軟骨的最重要的細(xì)胞因子之一。IL-1和TNF-α都能誘導(dǎo)IL-6的合成和分泌，與IL-1和TNF-α一樣, IL-6也是RA關(guān)節(jié)炎癥中主要的炎癥介質(zhì)。在RA中, IL-6的致病作用主要是增強(qiáng)IL-1和TNF-α的效應(yīng)，促進(jìn)白細(xì)胞活化和自身抗體產(chǎn)生，并與急性時(shí)相反應(yīng)和貧血、脂質(zhì)代謝紊亂等全身表現(xiàn)相關(guān)[16]。目前IL-6單克隆抗體已應(yīng)用于難治性RA臨床治療，取得不錯(cuò)的臨床療效[17]。TGF-β是一種抑制炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，由多種細(xì)胞產(chǎn)生，主要進(jìn)入關(guān)節(jié)滑膜，與基質(zhì)成分結(jié)合在一起，發(fā)揮免疫抑制作用。TGF-β還可與細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)共同作用抑制免疫反應(yīng)。TGF-β對(duì)T、B、巨噬細(xì)胞及其他細(xì)胞有多重抑制作用[18-19]。

本研究證實(shí), CIA大鼠造模后踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及關(guān)節(jié)腔狹窄，炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)增高；經(jīng)UCMSCs治療后，CIA大鼠關(guān)節(jié)炎性腫脹減輕，關(guān)節(jié)間隙未見(jiàn)狹窄；炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)下調(diào)，抑炎細(xì)胞因子TGF-β表達(dá)上調(diào)；以上結(jié)果提示UCMSCs能通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子，上調(diào)抑炎因子從而緩解關(guān)節(jié)炎癥，減輕關(guān)節(jié)破壞。

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Effect observation of umbilical cord-derived

mesenchymal stem cells transplantation on

treatment of collagen-induced arthritis rats

ZHAOCheng,ZHANGLu,WANGHong,LIUBujun

(DepartmentofRheumatology,GulouHospitalAffiliatedtoMedicalSchoolofNanjing

University,Nanjing,Jiangsu, 210008)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UCMSCs) transplantation on treatment of collagen-induced arthritis (CIA) rats. MethodsForty CIA model of Wistar rats were randomly divided into MSCs transplantation group (MSC group,n=20), cells control group (FLS group,n=10) and disease control group (CIA group,n=10), and 10 normal Wistar rats were selected as normal control group. AI score was used to evaluate the degree of joint swelling in CIA rats. 1×106UCMSCs or FLSs was given through intravenous injection from tail veil on the 17th day in the MSC group and the FLS group. On the 42nd day, rats were sacrificed and sera were got for detecting TNF-α, TGF-β, IL-1β and IL-6. Ankle joint was got for pathological evaluation of the narrowing degree. ResultsArthritis scores of the MSC group were significantly lower than those of the CIA group and the FLS group (P<0.05). HE staining showed that inflammatory cells infiltration and arthrostenosis were amiliorated by MSC. High serum levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 were down-regulated through UCMSCs transplantation (P<0.05). There was no significant difference of TGF-β between the control group and the CIA group, but up-regulated after the infusion of UCMSCs (P<0.01). ConclusionUCMSCs transplantation can alleviate arthritis and cartilage damage in CIA rats by down regulating inflammatory cytokines of TNF-α, IL-1β, IL-6 and up regulating TGF-β.

KEYWORDS:rheumatoid arthritis; umbilical cord-derived mesenchymal stem cells; collagen-induced arthritis

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(81102258)

收稿日期:2014-12-21

中圖分類號(hào):R 684.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)09-001-04

DOI:10.7619/jcmp.201509001

論著