么宏偉，佟立君，付婷婷，張學(xué)義*，謝晨陽(yáng)，吳洪軍，趙鳳臣，馮 磊

(1.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江牡丹江 157011；2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150081)

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松茸濃縮口服液制備過(guò)程中堿性蛋白的提取研究

么宏偉1，佟立君2，付婷婷1，張學(xué)義1*，謝晨陽(yáng)1，吳洪軍1，趙鳳臣1，馮 磊2

(1.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江牡丹江 157011；2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150081)

[目的] 優(yōu)化松茸濃縮口服液制備過(guò)程中堿性蛋白的提取工藝。 [方法]以新鮮松茸為原料，利用超聲波輔助水提、弱堿鹽溶液提取和醇溶液提取三步提取法提取松茸中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，制備成了松茸濃縮口服液；并以弱堿鹽溶液提取松茸堿性蛋白，對(duì)影響因素碳酸氫鈉濃度、氯化鈉濃度、提取時(shí)間、提取溫進(jìn)行了正交試驗(yàn)分析，確定最佳工藝。 [結(jié)果]試驗(yàn)確定了弱堿鹽溶液提取松茸堿性蛋白的最佳工藝為：碳酸氫鈉濃度0.3%，氯化鈉濃度0.5%，提取時(shí)間150 min，提取溫度80 ℃；此條件下堿性蛋白質(zhì)的得率為1.16%。[結(jié)論] 試驗(yàn)打破了松茸在傳統(tǒng)口服液中利用率低的局限性，通過(guò)改變提取方式，增加了松茸濃縮液的提取率，大大提高了松茸的利用價(jià)值與經(jīng)濟(jì)效益。

松茸；提取方法；堿性蛋白

松茸[Tricholomamatsutake(S.Ito et Imai)Sing]，又名松口蘑，與溫帶和寒溫帶的松林與櫟林共生生長(zhǎng)，為共生菌[1]。野生松茸的生長(zhǎng)環(huán)境極為苛刻，需要依賴柏樹(shù)、橡樹(shù)等闊葉林為其生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)支持，只有這樣才能形成健康的子實(shí)體[2-3]。松茸含有豐富的氨基酸、維生素和脂肪及豐富的膳食纖維和多種活性酶，另含有3種珍貴的活性物質(zhì)，分別是雙鏈松茸多糖、松茸多肽和松茸醇[4-5]。松茸有很多保健功能，如提高免疫力、抗癌抗腫瘤、治療糖尿病及心血管疾病、抗衰老養(yǎng)顏和促腸胃保肝臟等多種功效[6-8]。筆者以新鮮松茸為原料，利用超聲波輔助水提、弱堿鹽溶液提取和醇溶液提取三步提取法提取松茸中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并制備成了松茸濃縮口服液。試驗(yàn)打破了松茸在傳統(tǒng)口服液中利用率低的局限性，通過(guò)改變提取方式，增加了松茸濃縮液的提取率，并結(jié)合口服液使用簡(jiǎn)單、方便，便于保藏等優(yōu)勢(shì)，大大提高了松茸的利用價(jià)值與經(jīng)濟(jì)效益。其中以弱堿鹽溶液提取松茸堿性蛋白，在試驗(yàn)中對(duì)碳酸氫鈉濃度、氯化鈉濃度、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)和分析，確定最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試原料。試驗(yàn)所需松茸來(lái)源于黑龍江省牡丹江市東寧縣。

1.1.2主要試劑。檸檬酸、正丁醇、肉豆蔻酯、EDTA、檸檬酸鈉、纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、碳酸鈉、氯化鈉、95%乙醇、葡萄糖、濃硫酸、苯酚、草酸、維生素C、偏磷酸、醋酸、氯酸銨、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、磷酸、沒(méi)食子酸、福林酚、熊果酸、香草醛、冰醋酸、高氯酸等試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器與設(shè)備。試驗(yàn)所用主要儀器設(shè)備見(jiàn)表1。

表1 主要試驗(yàn)儀器

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1原材料預(yù)處理。選擇新鮮、無(wú)病殘、無(wú)蟲蛀的松茸，于清水中洗凈，瀝水。將松茸子實(shí)體進(jìn)行切片處理；用電子天平稱量重量，加入20倍體積無(wú)菌蒸餾水，將切片后的松茸減壓浸漬在含有0.03%的檸檬酸、0.02%正丁醇與0.02%肉豆蔻酯的混合溶液中，減壓浸漬10 min。加入0.02%EDTA、0.2%檸檬酸鈉，用組織搗碎器將組織破壞。加入纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶，按6.8 g/L加入，3種酶的比例為1∶1∶1.4。

1.2.2弱堿鹽溶液提取工藝。

1.2.2.1弱堿鹽溶液提取工藝的優(yōu)化。為了得到松茸中的堿溶性成分，將超聲波輔助水提取后的殘?jiān)锰妓釟溻c與氯化鈉混合溶液進(jìn)行提取，以堿性蛋白質(zhì)的得率為檢測(cè)指標(biāo)確定最佳工藝。

以堿性蛋白質(zhì)的提取率為檢測(cè)指標(biāo)，稱取超聲波輔助水提取后的殘?jiān)?0 g，分別改變提取條件(碳酸氫鈉濃度、氯化鈉濃度、提取時(shí)間、提取溫度)4個(gè)因素，考察各因素對(duì)總提取率的影響，各因素水平設(shè)置如下：碳酸氫鈉濃度：0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%；氯化鈉濃度：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%；提取時(shí)間：30、60、90、120、150 min；提取溫度：50、60、70、80、90 ℃。

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用L9(34)正交表，由碳酸氫鈉濃度、氯化鈉濃度、提取時(shí)間、提取溫度作正交表，因素水平見(jiàn)表2。

表2 弱堿鹽溶液提取工藝的正交試驗(yàn)

1.2.2.2堿溶性物質(zhì)總得率的計(jì)算。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：首先將牛血清白蛋白用0.15 mol/ml的氯化鈉溶液配成1.0 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。再準(zhǔn)確稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 ml 95%的乙醇后，加入120 ml 85%的磷酸，用蒸餾水稀釋至1 L。取6支試管分別加入1.0 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml，然后用0.15 mol/ml氯化鈉溶液補(bǔ)充到1.0 ml，最后各試管分別加入5.0 ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑。每加完一管，立即在旋渦混合器上混勻。加完試劑2～5 min后，于595 nm處測(cè)吸光值。以牛血清白蛋白濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)，以吸光值(OD595)為縱坐標(biāo)，如圖1所示。

堿溶性蛋白質(zhì)得率的計(jì)算：取1 ml提取液，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出提取液中堿溶性蛋白質(zhì)的濃度，可計(jì)算：

堿溶性蛋白質(zhì)得率=提取液中堿溶性蛋白質(zhì)量/松茸質(zhì)量×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 碳酸氫鈉濃度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響在一定范圍內(nèi)，堿液可以使堿溶性蛋白質(zhì)析出，但是當(dāng)堿液濃度過(guò)大時(shí)，則可能使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，從而影響得率，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，堿溶性蛋白質(zhì)的得率在碳酸氫鈉濃度為0.3%時(shí)達(dá)到最大。碳酸氫鈉濃度小時(shí)，松茸中的堿溶性蛋白質(zhì)并沒(méi)有完全溶解到溶液中；而碳酸氫鈉濃度大時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性影響得率。所以，以碳酸氫鈉濃度0.3%為宜。

2.2 氯化鈉濃度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響低濃度的氯化鈉可以改變細(xì)胞膜表面的通透性，而高濃度的氯化鈉則會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，所以氯化鈉的濃度對(duì)蛋白質(zhì)的得率有一定的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，堿溶性蛋白質(zhì)的得率在氯化鈉濃度為1.0%時(shí)達(dá)到最大，而后隨著氯化鈉濃度增大而減少?？赡苁怯捎诼然c濃度過(guò)大導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性影響得率。所以，以氯化鈉濃度1.0%為宜。

2.3 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響提取時(shí)間直接反映溶液對(duì)松茸的作用效果，只有達(dá)到一定的提取時(shí)間，才能使松茸中的堿溶性成分最大的浸出，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)的得率也逐漸增加，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到120 min時(shí)，得率基本保持不變，從消耗能源和蛋白質(zhì)得率考慮，以提取時(shí)間120 min為宜。

2.4 提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響溫度會(huì)影響溶液的熱效應(yīng)，高溫可以使溶液中的水分子運(yùn)動(dòng)加速，有利于蛋白質(zhì)的溶解，但是溫度過(guò)高會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生變性反應(yīng)降低得率，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著提取溫度的增加，蛋白質(zhì)的得率也逐漸增加，當(dāng)提取溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，得率基本保持不變，從消耗能源和蛋白質(zhì)得率考慮，以提取溫度70 ℃為宜。

2.5 弱堿鹽溶液提取工藝正交試驗(yàn)為得到最優(yōu)提取條件而進(jìn)行正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)了3水平4因素的正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，具體試驗(yàn)方案與結(jié)果分析見(jiàn)表3。由表3可以看出，通過(guò)極差分析，得到因素顯著性主次順序?yàn)闇囟?時(shí)間>氯化鈉水濃度>碳酸氫鈉濃度。比較試驗(yàn)結(jié)果可以得出4個(gè)因素的最佳組成為：碳酸氫鈉濃度0.3%，氯化鈉濃度0.5%，提取時(shí)間150 min，提取溫度80 ℃。方差分析顯示，F(xiàn)A=1.000，F(xiàn)B=7.750，F(xiàn)C=10.875，F(xiàn)D=21.000，F(xiàn)臨界值=19.000。結(jié)果表明，溫度對(duì)弱堿鹽提取的影響達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

在最佳工藝條件下測(cè)得弱堿鹽提取液中的堿性蛋白質(zhì)得率為1.16%。

3 結(jié)論

為了得到松茸中的堿性蛋白成分，用碳酸氫鈉與氯化鈉混合溶液進(jìn)行提取，以堿性蛋白質(zhì)的得率為檢測(cè)指標(biāo)確定最佳工藝。分別改變提取條件(碳酸氫鈉濃度、氯化鈉濃度、提取時(shí)間、提取溫度)4個(gè)因素，考察各因素對(duì)總提取率的影響，通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)得到了松茸堿性蛋白提取的最優(yōu)條件和測(cè)定計(jì)算了堿性蛋白。弱堿鹽溶液提取堿性蛋白質(zhì)的最佳提取工藝：碳酸氫鈉濃度0.3%，氯化鈉濃度0.5%，提取時(shí)間150 min，提取溫度80 ℃；此條件下堿性蛋白質(zhì)的得率為1.16%。

表3 弱堿鹽溶液提取率正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

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Extraction of Alkaline Protein in the Preparation Process of Condensed Oral Liquid ofTricholomamatsutake

YAO Hong-wei1, TONG Li-jun2, FU Ting-ting1, ZHANG Xue-yi1*et al

(1. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Non-wood Forest Product Development, Heilongjiang Forest By-Product and Speciality Research Institute, Mudanjiang, Heilongjiang 157011; 2. Heilongjiang Academy of Forestry, Harbin, Heilongjiang 150081)

[Objective] To optimize extraction technique of alkaline protein in preparation process ofTricholomamatsutakecondensed oral liquid. [Method] With freshTricholomamatsutakeas raw material, using ultrasonic extraction, weak base salt solution extraction and alcohol solution to extract nutrients ofTricholomamatsutake; weak base salt solution was adopted to extract alkaline protein, orthogonal test was used to analyze influencing factors of sodium bicarbonate concentration, sodium chloride, extraction time, extraction temperature. [Result] The optimum process is as follows: sodium salt solution concentration of 0.3%, saline concentration of 0.5%, extraction time 150 min, extraction temperature 80 ℃; weak base yields an alkaline salt solution extracted proteins reach 1.16%. [Conclusion] Through changing extraction method, yield ofTricholomamatsutakeconcentrated liquid was improved, which significant increase utilization value and economic benefit ofTricholomamatsutake.

Tricholomamatsutake; Extraction method; Alkaline protein

黑龍江省森林工業(yè)總局科技攻關(guān)項(xiàng)目(sgzjY2012022)。

么宏偉(1981- )，男，黑龍江牡丹江人，助理研究員，從事林產(chǎn)化學(xué)加工學(xué)研究。*通訊作者，研究員，從事林產(chǎn)化學(xué)加工學(xué)研究。

2015-01-13

S 646.1+5

A

0517-6611(2015)06-267-03