湯玉清，徐 毅，潘麗爽，汪惠麗

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009)

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嗜酸乳桿菌生產(chǎn)共軛亞油酸的發(fā)酵條件研究

湯玉清，徐 毅*，潘麗爽，汪惠麗

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009)

[目的]為提高微生物法發(fā)酵合成共軛亞油酸(CLA)的產(chǎn)量，優(yōu)化嗜酸乳桿菌生產(chǎn)共軛亞油酸的發(fā)酵條件。[方法]試驗以亞油酸為底物，利用嗜酸乳桿菌合成共軛亞油酸，選取對CLA的生成量影響顯著的幾個因素：底物濃度、接種量、pH、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度進(jìn)行單因素試驗，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗優(yōu)化發(fā)酵條件。 [結(jié)果]單因素試驗得到的最優(yōu)發(fā)酵條件為底物濃度1.0 mg/ml、接種量4%、初始pH 5.5、發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度37 ℃。正交試驗發(fā)現(xiàn)，底物濃度、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度顯著影響CLA的合成產(chǎn)量。最終得到的最優(yōu)發(fā)酵條件為底物濃度為1.5 mg/ml、接種量2%、初始pH 5.5、發(fā)酵時間36 h、發(fā)酵溫度33 ℃。用氣質(zhì)聯(lián)用法對產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，證明產(chǎn)物是c-9,t-11 CLA。此時，CLA的產(chǎn)量為91.54 μg/ml。[結(jié)論]試驗優(yōu)化了共軛亞油酸的發(fā)酵條件，為更有效率地利用嗜酸乳桿菌生產(chǎn)共軛亞油酸提供了理論依據(jù)。

共軛亞油酸；嗜酸乳酸桿菌；發(fā)酵條件

共軛亞油酸(CLA)是亞油酸的同分異構(gòu)體，是普遍存在于動物和人體內(nèi)的天然活性營養(yǎng)物質(zhì)[1]。作為一種營養(yǎng)物質(zhì)，CLA從抗癌、減肥到防止動脈硬化、防治糖尿病等方面，都有廣泛的應(yīng)用，具有廣闊的應(yīng)用前景[2-7]。目前，CLA的合成方法主要有化學(xué)合成法、酶催化合成法、微生物合成法，目前合成CLA的最常用的方法是堿性異構(gòu)化的化學(xué)方法，但化學(xué)合成的CLA的各種不同的異構(gòu)體混雜在一起，這導(dǎo)致后期CLA的分離純化變得尤其復(fù)雜和困難，為工業(yè)化生產(chǎn)帶來很多不便。與之相比，CLA的微生物合成法由于亞油酸異構(gòu)酶具有專一性，將亞油酸專一地轉(zhuǎn)化成CLA(c-9，t-11)，便于分離純化。特別是乳酸菌，菌種易于獲得且不容易被雜菌污染，易于培養(yǎng)，產(chǎn)CLA的能力與其他菌種相比相對較高，而且乳酸菌還是人體益生菌。相比于微生物合成法，酶催化合成法需要更高的生產(chǎn)成本。從分離工藝難易程度和經(jīng)濟(jì)學(xué)效應(yīng)兩方面比較，用乳酸菌合成共軛亞油酸具有更好的發(fā)展前景[8-12]。

筆者以嗜酸乳桿菌為試驗菌種，以亞油酸為反應(yīng)底物，采用MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種，分別探究底物濃度、接種量、初始pH、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度對CLA產(chǎn)量的影響。根據(jù)單因素結(jié)果采用正交試驗，通過方差分析法，得到了最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件。發(fā)酵液中的CLA經(jīng)有機(jī)溶劑萃取后，用氣質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行定性分析，確定產(chǎn)物成分為c-9，t-11。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種與培養(yǎng)基。選擇嗜酸乳桿菌為試驗菌種，菌種由山東大學(xué)提供，試驗之前先對菌種進(jìn)行活化。

MRS培養(yǎng)基(W/V)：葡萄糖2%，檸檬酸三銨0.2%，硫酸鎂0.02%，硫酸錳0.005%，蛋白胨1.0%，乙酸鈉0.5%，磷酸氫二鉀0.2%，酵母粉0.5%，牛肉膏1.0%，吐溫-80 0.1%(V/V)。亞油酸乳化后，再過濾除菌，根據(jù)需要加入培養(yǎng)基。

1.1.2主要試劑。蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、亞油酸等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；濃硫酸，無錫市展望化工試劑有限公司。

1.1.3主要儀器。TU-1901型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀，江蘇萬科科教儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；冷凍離心機(jī)，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海制成分析儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1發(fā)酵液中CLA生成量的測定。該試驗以最終發(fā)酵產(chǎn)物中CLA的產(chǎn)量為評價指標(biāo)，采用紫外檢測法測定CLA的含量[13]。用正己烷將CLA純品稀釋成不同的濃度，然后以正己烷為空白對照，測定不同濃度CLA在波長233 nm處的吸光值，并繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，得到線性回歸方程為y=0.127 9x+0.025 6，R2=0.999 7。

發(fā)酵結(jié)束之后，將發(fā)酵液倒入50 ml的離心管中，在5 000 r/min的條件下離心5 min。離心后將上清液倒入250 ml的分液漏斗中，加入25 ml的正己烷萃取，之后靜置分層，下層丟棄，上層用蒸餾水水洗2次，將水層棄去后用無水硫酸鈉將上層干燥。之后將上清液取出定容到25 ml。隨后從中吸取1 ml，并用正己烷定容到15 ml，以正己烷為參比，測定其在波長233 nm處的紫外吸光值。

1.2.2單因素試驗。

1.2.2.1底物濃度對CLA產(chǎn)量的影響。接種量為2%，培養(yǎng)溫度37 ℃，發(fā)酵24 h，初始pH為6.8，底物濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/ml，其他條件均相同，考察底物濃度對CLA產(chǎn)量的影響。每組試驗進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果取其平均值，選取較為適宜的底物濃度。

1.2.2.2接種量對CLA產(chǎn)量的影響。底物濃度采用“1.2.2.1”得出的最佳底物濃度，接種量分別為0%、2%、4%、6%、8%，培養(yǎng)溫度37 ℃，發(fā)酵24 h，初始pH為6.8，其他條件均相同，考察接種量對CLA產(chǎn)量的影響。每組試驗進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果取其平均值，選取較為適宜的接種量。

1.2.2.3初始pH對CLA產(chǎn)量的影響。底物濃度采用“1.2.2.1”得出的最佳底物濃度，接種量采用“1.2.2.2”得出的最佳接種量，培養(yǎng)溫度37 ℃，發(fā)酵24 h，初始pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，其他條件均相同，考察初始pH對CLA產(chǎn)量的影響。每組試驗進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果取其平均值，選取較為適宜的初始pH。

1.2.2.4培養(yǎng)時間對CLA產(chǎn)量的影響。底物濃度采用“1.2.2.1”得出的最佳底物濃度，接種量采用“1.2.2.2”得出的最佳接種量，培養(yǎng)溫度37 ℃，初始pH采用“1.2.2.3”得出的最佳初始pH，發(fā)酵時間分別為12、24、36、48、60 h，其他條件均相同，考察培養(yǎng)時間對CLA產(chǎn)量的影響。每組試驗進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果取其平均值，選取較為適宜的培養(yǎng)時間。

1.2.2.5培養(yǎng)溫度對CLA產(chǎn)量的影響。底物濃度采用“1.2.2.1”得出的最佳底物濃度，接種量采用“1.2.2.2”得出的最佳接種量，初始pH采用“1.2.2.3”得出的最佳初始pH，發(fā)酵時間采用“1.2.2.4”得出的最佳發(fā)酵時間，培養(yǎng)溫度分別為25、29、33、37、41 ℃，其他條件均相同，考察培養(yǎng)溫度對CLA產(chǎn)量的影響。每組試驗進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果取其平均值，選取較為適宜的培養(yǎng)溫度。

1.2.3正交試驗。根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選擇合適的正交表進(jìn)行正交試驗，每組試驗進(jìn)行3次重復(fù)，并對正交試驗的結(jié)果進(jìn)行方差分析，得出最優(yōu)發(fā)酵條件[14]。

1.2.4氣質(zhì)聯(lián)用法定性分析。在最佳培養(yǎng)條件下發(fā)酵合成CLA，將發(fā)酵液與200 ml的氯仿甲醇(2∶1)溶液混合，均質(zhì)5 min，再用冷凍離心機(jī)在4 ℃，5 000 r/min條件下離心5 min，棄去上層，下層用無水硫酸鈉干燥，之后將干燥好的溶液轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)，在30 ℃條件下蒸去大多數(shù)溶劑，剩余部分轉(zhuǎn)移到離心管中用氮?dú)鈱⑹Ｓ嗳軇┐底?。向剩余的物質(zhì)中加入1 ml 1 mol/L的硫酸甲醇溶液，并在60 ℃條件下水浴30 min，水浴結(jié)束后自然冷卻。然后加入1 ml的正己烷，振蕩30 s，用冷凍離心機(jī)在4 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min，用GC-MS進(jìn)行定性分析，亞油酸標(biāo)品經(jīng)相同處理后作對照。選用CP-Sil88(100 m×0.25 mm×0.25 μm)強(qiáng)極性色譜柱，升溫程序：色譜柱的初溫140 ℃，在此溫度下維持5 min，然后再以7 ℃/min的速度將溫度上升至175 ℃，在此溫度下維持5 min，再以5 ℃/min的速度將溫度上升至200 ℃，最后再以0.3 ℃/min的速度將溫度上升至210 ℃，維持15 min。載氣為氦氣，進(jìn)樣口的溫度為220 ℃，流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣量為1.0 μl，分流比為30∶1，檢測器的溫度為220 ℃。選用EI離子源，其溫度為220 ℃，連接口的溫度為250 ℃，掃描質(zhì)量數(shù)的范圍設(shè)為100～350。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1底物濃度對CLA產(chǎn)量的影響。根據(jù)“1.2.2.1”的試驗條件，進(jìn)行底物濃度對CLA產(chǎn)量的影響試驗。由圖2可知，底物濃度在0～1.0 mg/ml范圍內(nèi)，CLA的生成量呈上升趨勢，并且在底物濃度為1.0 mg/ml的時候達(dá)到最高值。但當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?.0 mg/ml時，CLA的生成量反而減少。這可能是因為亞油酸對細(xì)胞有毒害作用，它的濃度過高會抑制細(xì)胞和酶的活性，從而導(dǎo)致CLA的生成量降低。綜合考慮，底物濃度控制在1.0 mg/ml左右比較合適。

2.1.2接種量對CLA產(chǎn)量的影響。根據(jù)“1.2.2.2”的試驗條件，進(jìn)行接種量對CLA產(chǎn)量影響的試驗，試驗結(jié)果如圖 3所示。接種量在0～4%范圍內(nèi)，CLA的生成量呈上升趨勢，并且在接種量為4%的時候達(dá)到最高值。但當(dāng)接種量大于4%時，CLA的生成量反而減少。這可能是因為接種量過多時培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)相對不足，微生物活性不高，從而導(dǎo)致CLA的生成量降低。綜合考慮，接種量應(yīng)控制在4%左右比較合適。

2.1.3初始pH對CLA產(chǎn)量的影響。根據(jù)“1.2.2.3”的試驗條件，進(jìn)行初始pH對CLA產(chǎn)量影響的試驗。紫外檢測結(jié)果如圖4所示，初始pH在5.0～5.5范圍內(nèi)，CLA的生成量呈上升趨勢，并且在初始pH為5.5的時候達(dá)到最高值。但當(dāng)初始pH大于5.5時，CLA的生成量反而減少。這可能是因為每種微生物都有適合自己生長的最適pH，培養(yǎng)液pH過高或過低都會影響微生物的活性，從而導(dǎo)致CLA的生成量降低。綜合考慮，初始pH應(yīng)控制在5.5左右比較合適。

2.1.4培養(yǎng)時間對CLA產(chǎn)量的影響。根據(jù)“1.2.2.4”的試驗條件，進(jìn)行培養(yǎng)時間對CLA產(chǎn)量影響的試驗。結(jié)果如表5所示，培養(yǎng)時間在12～48 h范圍內(nèi)，CLA的生成量呈上升趨勢，并且在培養(yǎng)時間為48 h的時候達(dá)到最高值。但當(dāng)培養(yǎng)時間大于48 h時，CLA的生成量反而減少。這可能是因為一方面，隨時間的延長微生物生長進(jìn)入衰退期，活性降低，產(chǎn)CLA的能力下降；另一方面，隨時間的延長，部分已生成的CLA可能逐漸發(fā)生硬脂化，從而導(dǎo)致CLA的生成量降低。綜合考慮，培養(yǎng)時間應(yīng)控制在48 h左右比較合適。

2.1.5培養(yǎng)溫度對CLA產(chǎn)量的影響。根據(jù)試驗“1.2.2.5”的試驗條件，進(jìn)行培養(yǎng)溫度對CLA產(chǎn)量影響的試驗。結(jié)果如圖6所示，培養(yǎng)溫度在25～37 ℃范圍內(nèi)，CLA的生成量呈上升趨勢，并且在培養(yǎng)溫度為37 ℃的時候達(dá)到最高值。但當(dāng)培養(yǎng)溫度大于37 ℃時，CLA的生成量反而減少。這可能是因為亞油酸受到亞油酸異構(gòu)酶的催化從而轉(zhuǎn)化生成為CLA，而每種酶都有最適溫度，環(huán)境的溫度太高或太低都會影響酶活，從而導(dǎo)致CLA的生成量降低。綜合考慮，培養(yǎng)溫度為37 ℃左右時有利于CLA的合成。

2.2 正交試驗結(jié)果根據(jù)單因素試驗結(jié)果結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)資料，選取對CLA的生成量影響顯著的4個因素：底物濃度、接種量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度進(jìn)行正交試驗，各因素水平如表1所示，選擇L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗，試驗方案及試驗結(jié)果如表2所示。

表1 正交試驗因素水平設(shè)計

由表2可以直接看出，CLA生成量最高的一組各因素組合條件為A3B1C3D2，即底物濃度1.5 mg/ml，接種量2%，發(fā)酵時間60 h，發(fā)酵溫度37 ℃。根據(jù)表2中各因素K值的大小，得到的最佳組合條件為A3B1C1D1，即底物濃度1.5 mg/ml，接種量2%，發(fā)酵時間36 h，發(fā)酵溫度33 ℃。對正交試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果得出FA=17.6***,FB=3.3，F(xiàn)C=3.7*，F(xiàn)D=4.9*；其中F0.001(2,18)=10.39，F(xiàn)0.01(2,18)=6.01，F(xiàn)0.05(2,18)=3.55。

表2 正交試驗結(jié)果

由方差分析結(jié)果可知，各因素的主次順序由主到次為A、D、C、B。由于直接分析最好的組合條件和計算分析最好的組合條件在C(時間)和D(溫度)的取值上不一致，因此將這2種組合條件進(jìn)行驗證性試驗，并綜合考慮經(jīng)濟(jì)效應(yīng)和適用性等因素，從而確定最佳組合條件，其方案及結(jié)果如表3所示。

表3 驗證性試驗結(jié)果

結(jié)果表明，A3B1C1D1為最優(yōu)組合條件，在此條件下，CLA的生成量經(jīng)計算為91.54 μg/ml。最終得到的最優(yōu)發(fā)酵條件為底物濃度為1.5 mg/ml，接種量2%，初始pH為5.5，培養(yǎng)時間36 h，培養(yǎng)溫度33 ℃。

2.3 氣質(zhì)聯(lián)用定性分析結(jié)果根據(jù)試驗“1.2.4”的試驗條件，用氣質(zhì)聯(lián)用法對產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出，與亞麻酸標(biāo)品色譜圖(圖7a)相比，產(chǎn)物色譜圖(圖7b)中生成了一種新的物質(zhì)，這種物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜分析結(jié)構(gòu)如圖8所示，為c-9，t-11CLA，得出亞油酸在試驗所給條件下，轉(zhuǎn)化生成了c-9，t-11CLA。

3 結(jié)論

以最終發(fā)酵產(chǎn)物中CLA的產(chǎn)量為評價指標(biāo)，通過單因素和正交試驗優(yōu)化了嗜酸乳桿菌合成共軛亞油酸的工藝條件。單因素試驗確定了較優(yōu)發(fā)酵條件分別為底物濃度1.0 mg/ml、接種量 4%、初始pH 5.5、培養(yǎng)時間48 h和培養(yǎng)溫度37 ℃。根據(jù)單因素試驗結(jié)果結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)資料，采用正交試驗進(jìn)一步研究了底物濃度、接種量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度對CLA的產(chǎn)量的影響，最終得到的最優(yōu)發(fā)酵條件為底物濃度為1.5 mg/ml、接種量2%、初始pH為5.5、培養(yǎng)時間36 h和培養(yǎng)溫度33 ℃。并用氣質(zhì)聯(lián)用法對發(fā)酵產(chǎn)物成分進(jìn)行了分

析，證明產(chǎn)物是c-9，t-11CLA，此時，CLA的產(chǎn)量為91.54 μg/ml。

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Study on the Fermentation Conditions of Producing Conjugated Linoleic Acid byLactobacillusacidophilus

TANG Yu-qing, XU Yi*, PAN Li-shuang et al

(College of Biological and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei, Anhui 230009)

[Objective] To improve the synthesis of conjugated linoleic acid (CLA), optimize the fermentation conditions of producing conjugated linoleic acid byLactobacillusacidophilus. [Method] With linoleic acid as substrate, four factors (substrate concentration, inoculation quantity, fermentation time, fermentation temperature) were selected to carry out single factor test, which significantly impacted the generation of CLA, on the basis of this, orthogonal test was conducted to optimize fermentation conditions. [Result] Single factor experiment reflected that the optimal fermentation conditions were the substrate concentration 1.0 mg/ml, inoculation quantity 4%, initial pH 5.5, fermentation time 48 h, fermentation temperature 37 ℃. The orthogonal test found that the substrate concentration, fermentation time and fermentation temperature had significant influence on the production of CLA. Finally, the optimal fermentation conditions were obtained: the substrate concentration 1.5 mg/ml, inoculation amount 2%, initial pH 5.5, incubation time 36 h, incubation temperature 33 ℃. GC-MS was used to conduct qualitative analysis of the product. It turned out that the product was c-9, t-11 CLA. At this point, the production of CLA was 91.54 μg/ml. [Conclusion] In summary, the fermentation conditions pertaining to the synthesis of CLA was optimized in this study, facilitating the more efficient use of this CLA biosynthetic processes.

Conjugated linoleic acid;Lactobacillusacidophilus; Fermentation condition

國家自然科學(xué)基金青年基金項目(31401671)。

湯玉清(1987- )，男，安徽六安人，碩士研究生，研究方向：食品營養(yǎng)與神經(jīng)毒理。*通訊作者，講師，博士，從事微生物與食品方面的研究。

2014-12-29

S 188+.4

A

0517-6611(2015)06-272-04