白文靜，吳新欣，劉 謙，劉麗麗，周 楊，方孟影

(河北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心保定分中心，河北保定 071051)

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HPLC法測(cè)定乳制品中的黃曲霉毒素M1

白文靜，吳新欣，劉 謙*，劉麗麗，周 楊，方孟影

(河北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心保定分中心，河北保定 071051)

[目的]建立高效液相色譜法測(cè)定乳制品中黃曲霉毒素M1的測(cè)定方法。[方法]供試乳制品經(jīng)提取、凈化后用高效液相色譜法測(cè)定其中黃曲霉素M1的含量。[結(jié)果]黃曲霉毒素M1在2～10 ng/ml范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r=0.995 9，平均回收率為96.7%，檢出限為0.4 μg/kg。[結(jié)論]研究所用方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較好，可用于乳制品中黃曲霉毒素M1含量的測(cè)定。

乳制品；黃曲霉毒素M1；高效液相色譜法；含量測(cè)定

黃曲霉毒素在1993年被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer)劃定為 Ⅰ 類致癌物(明確的人類致癌物), 是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，其毒性是氰化鉀的10倍，主要表現(xiàn)為致癌、致畸、致突變[1]。黃曲霉毒素M1對(duì)熱非常穩(wěn)定，299 ℃才會(huì)被破壞，在一般烹調(diào)溫度、巴氏殺菌或者高溫殺菌條件下幾乎都不會(huì)被破壞[2]。哺乳動(dòng)物在攝入被黃曲霉毒素B1污染的飼料或食品后，在體內(nèi)的肝微粒體單氧化酶系催化下，被羥基化生成的二次毒性代謝產(chǎn)物為黃曲霉毒素M1[3]。黃曲霉毒素M1在進(jìn)入人體或動(dòng)物體后，除了抑制DNA、RNA合成外, 也會(huì)抑制肝臟蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致人體中毒[4]。該毒素主要危害的部位在肝臟，其危害主要表現(xiàn)在損害組織器官、引發(fā)動(dòng)物及人類的肝癌、腎癌和胃癌等抑制免疫機(jī)能[5]，其毒性是氰化鉀的10倍、砒霜的68倍。黃曲霉毒素M1一部分從尿和乳汁中排出, 一部分存在于動(dòng)物細(xì)胞的可食部分如肝、蛋類、 腎、 血和肌肉中, 其中以乳最為常見(jiàn)[6]。牛乳及其制品是易受黃曲霉毒素M1污染的食品之一，對(duì)牛奶中黃曲霉毒素M1準(zhǔn)確定量(如我國(guó)規(guī)定牛奶中黃曲霉毒素M1的最大殘留限量為0.5 μg/kg[7])，了解真實(shí)污染水平，對(duì)維護(hù)人群健康具有重要意義。

HPLC 法是利用免疫親和柱或C18柱將樣品中的黃曲霉毒素M1 萃取、凈化、濃縮、分離，再通過(guò)HPLC 串聯(lián)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)[8]。免疫親和柱是利用抗原抗體的特異性吸附特性, 親和柱只能特異性、選擇性地吸附黃曲霉毒素，而其他雜質(zhì)則順利通過(guò)柱子, 然后再利用洗脫液將黃曲霉毒素洗脫下來(lái)[9]。該方法大大簡(jiǎn)化了樣品的前處理過(guò)程, 且利用高效液相色譜法可同時(shí)進(jìn)行定量和定性黃曲霉毒素M1,具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，得到廣泛的應(yīng)用[10]。

1 材料與方法

1.1 材料供檢測(cè)樣品為某品牌幼兒奶粉。島津LC-20AT高效液相色譜儀，附帶RF-20A熒光檢測(cè)器；KQ-500超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；離心機(jī)，轉(zhuǎn)速7 000 r/min；氮吹儀；黃曲霉毒素M1免疫親和柱，北京泰樂(lè)祺科技有限公司；黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液，純度≥98%。

1.2 方法

1.2.1色譜條件。色譜柱：C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈+水(25+75)；流速：1.0 ml/min；柱溫：40 ℃；熒光檢測(cè)器：365 nm激發(fā)波長(zhǎng)、435 nm發(fā)射波長(zhǎng)；進(jìn)樣體積：10 μl。

1.2.2線性關(guān)系。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液儲(chǔ)備液(濃度：0.5 μg/ml)用10%乙腈適當(dāng)稀釋后制得濃度分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果表明，黃曲霉毒素M1在2～10 ng/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。線性方程如下：Y=aX+b(a=2.422 222e-003，b=0.710 529 5)，R2=0.991 847 5，R=0.995 915 4。

1.2.3試樣前處理。稱取混合均勻的奶粉平行樣10 g置于250 ml燒杯中，將50 ml已預(yù)熱到50 ℃的水多次少量加入到乳粉中，攪拌使其溶解，冷卻后置于100 ml容量瓶中，多次少量水淋洗轉(zhuǎn)移，定容至刻度，濾紙過(guò)濾或4 000 r/min離心15 min，至少收集50 ml乳試樣，備用。

將免疫親和柱連接在50 ml玻璃注射器下，準(zhǔn)確量乳試樣50 ml加入玻璃注射器，與真空泵相連,控制試樣以2～3 ml/min穩(wěn)定的流速過(guò)柱。注入10 ml純水分淋洗免疫親和柱。棄去全部流出液，抽干親和柱。加入4.0 ml色譜級(jí)乙腈洗脫，收集全部洗脫液于玻璃試管中，然后30 ℃氮吹至近干，用水定容至1 ml,供LC測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 工作曲線配制濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ng/ml的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

2.2 檢出限將標(biāo)準(zhǔn)品溶液儲(chǔ)備液適當(dāng)稀釋后制得一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣分析，以信噪比3∶1作為檢出限，得出黃曲霉毒素M1的檢出限為0.4 μg/kg。

2.3 精密度試驗(yàn)取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果表明，黃曲霉毒素M1的RSD為2.60%，精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)取試樣(以乳粉為例)，每試樣6份平行樣，分別照供試品溶液制備項(xiàng)下方法操作，結(jié)果表明，黃曲霉毒素M1的RSD為6.0%，重復(fù)性良好。

2.5 回收率試驗(yàn)取黃曲霉毒素M1陰性的乳粉10 g，加入濃度為0.5 μg/ml的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.04 ml，照供試品溶液制備項(xiàng)下方法依法操作，測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃曲霉毒素M1加標(biāo)回收試驗(yàn)(n=6)

2.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定機(jī)國(guó)際實(shí)驗(yàn)室能力測(cè)試結(jié)果取黃曲霉毒素M1陽(yáng)性的奶粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5 g(真值為0.6 μg/kg)，每試樣3份平行樣，分別按供試品溶液制備方法操作，測(cè)得結(jié)果均在允許范圍內(nèi)，與真值相接近。采用此方法參加由遼寧局實(shí)驗(yàn)室測(cè)量審核，以奶粉為測(cè)試樣品,結(jié)果令人滿意。

3 討論

該試驗(yàn)建立了高效液相色譜法測(cè)定乳制品中的黃曲霉毒素M1的方法。此方法基于免疫親和柱對(duì)黃曲霉毒素吸附的專一性,利用HPLC的良好分離效果,達(dá)到了靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)效果；同時(shí)，此方法簡(jiǎn)單易行，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均較好，適合于大批量樣品的檢測(cè)。

[1] 周貽兵，林野，李磊，等.高效液相色譜法測(cè)定牛奶中黃曲霉毒素M1的含量[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2014，35(15)：96-98.

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[3] 王軍淋，蔡增軒，任一平.超高效液相色譜-大體積流通池?zé)晒夥z測(cè)奶及奶制品中的黃曲霉毒素M1[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,39(2):191-196.

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HPLC Determination of Aflatoxin M1 in Dairy Products

BAI Wen-jing, WU Xin-xin, LIU Qian*et al

(Baoding Branch of Inspection and Quarantine Technical Center, Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Baoding, Hebei 071051)

[Objective] A method using high performance liquid chromatography for the determination of Aflatoxin M1 in dairy products was presented. [Method] Sample was determined the content by HPLC after extraction and purification. [Result] Aflatoxin M1 had good linear within the scope of 2-10 ng/ml and the correlation indexr=0.995 9. The limit of detection (LOD) of the method was 0.4 μg/kg. The recovery of Aflatoxin M1 was 96.7%. [Conclusion] This method was simple, accurate, and had good stability and reproducibility for the determination of Aflatoxin M1 in dairy products.

Dairy products; Aflatoxin M1; High-performance liquid chromatography; Determination

白文靜(1990-)，女，河北定州人，從事食品中添加劑、農(nóng)藥殘留的檢測(cè)研究。*通訊作者，工程師，碩士，從事食品、紡織品中藥物殘留、添加劑等的檢測(cè)研究。

2015-01-08

S 879.1

A

0517-6611(2015)06-270-02