陳年均 李明新

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·基礎(chǔ)研究·

康柏西普對人視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞生長和水通道蛋白4表達(dá)的影響

陳年均 李明新

目的 探討新型抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)康柏西普注射液對視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞生長和水通道蛋白4(AQP4)表達(dá)的影響。方法 將培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞分為5組：正常對照組、高糖組(25 mmol/L葡萄糖)和藥物組(給予低劑量0.25 μg/mL、中劑量2.5 μg/mL、高劑量25 μg/mL的康柏西普)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測細(xì)胞上清液中VEGF的分泌情況，采用CCK8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞生長情況，采用半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western印跡法檢測AQP4的表達(dá)情況。結(jié)果 康柏西普顯著抑制了高糖狀態(tài)下Müller細(xì)胞VEGF的分泌，但對高糖處理引起的Müller細(xì)胞活力下降并無明顯改善；康柏西普明顯抑制了高糖誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞AQP4表達(dá)增加，并呈劑量依賴性。結(jié)論 康柏西普是一種高效的VEGF拮抗劑，可以通過降低Müller細(xì)胞AQP4的表達(dá)緩解視網(wǎng)膜水腫，但對Müller細(xì)胞本身的生長并無影響。(中國眼耳鼻喉科雜志，2015，15：318-323)

康柏西普；Müller細(xì)胞；水通道蛋白4；視網(wǎng)膜水腫

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病眼病不可逆盲的最嚴(yán)重并發(fā)癥，是50歲以上患者重要的致盲原因，在西方則成為首要致盲原因[1]。而視網(wǎng)膜水腫是DR的最常見并發(fā)癥之一。國內(nèi)一項(xiàng)調(diào)查顯示：我國糖尿病患者日漸增多，而糖尿病患者中DR的患病率高達(dá)44%～51.3%[2]。近年來有研究[3]發(fā)現(xiàn)，DR患者眼內(nèi)尤其是玻璃體腔內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)含量增高是DR發(fā)展、惡化的關(guān)鍵原因。內(nèi)源性VEGF還作用于許多非血管性細(xì)胞，如視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞和光感受器細(xì)胞，并對視功能具有保護(hù)作用[4]。Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜內(nèi)最主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在糖尿病患者和動(dòng)物模型視網(wǎng)膜病理過程中反應(yīng)性激活[5-9]。DR在早期新生血管形成之前，就出現(xiàn)VEGF表達(dá)增加[5-10]，這種VEGF的增加主要是由視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞分泌[11]。

水通道蛋白(aquaporin，AQP)又名水孔蛋白，是一種位于細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)(內(nèi)在膜蛋白)，在細(xì)胞膜上組成“孔道”，可控制水在細(xì)胞的進(jìn)出。目前已知哺乳類動(dòng)物體內(nèi)的AQP有13種。AQP4是一種雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要表達(dá)在血管周圍Müller細(xì)胞終板膜和內(nèi)界膜內(nèi)。最近的研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，在許多缺氧、缺血視網(wǎng)膜病，如DR、視網(wǎng)膜靜脈阻塞中，存在AQP4異常表達(dá)，這表明AQP4與視網(wǎng)膜水腫相關(guān)。

康柏西普(conbercept)是我國首個(gè)自主研發(fā)的眼用抗VEGF注射液，臨床上用于治療濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(wet age-related macular degeneration, wAMD)，效果顯著[14-17]。國外同類的抗VEGF藥物(如貝伐單抗、雷珠單抗)均可用于治療wAMD和DR引起的視網(wǎng)膜水腫[18]。然而，康柏西普是否也能應(yīng)用于DR引起的視網(wǎng)膜水腫目前尚罕見相關(guān)報(bào)道。本課題擬以體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞為研究對象，初步探討康柏西普對Müller細(xì)胞生長和AQP4表達(dá)的影響，旨在為康柏西普用于治療DR引起的視網(wǎng)膜水腫提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞(上海力湃生物科技有限公司)，康柏西普(成都康弘生物科技有限公司)，DMEM、DMEM/HIGH GLUCOSE[賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司]，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Gibco公司)，CCK8試劑盒(北京利維寧生物科技有限公司)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)，Trizol(北京TIANGEN公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京TIANGEN公司)，AQP4單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，HRP標(biāo)記的二抗(Millipore公司)。

1.2 方法 ELISA：將培養(yǎng)處于指數(shù)生長期的Müller細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對照組、高糖組(25 mmol/L)、藥物處理組。藥物處理組給予不同濃度的康柏西普，又分為低劑量(0.25 μg/mL)、中劑量(2.5 μg/mL)和高劑量(25 μg/mL)。48 h后吸取細(xì)胞上清液，3 000×g離心15 min，取上清液，應(yīng)用ELISA檢測不同劑量的康柏西普對Müller細(xì)胞VEGF分泌水平的影響。

CCK8：調(diào)整Müller細(xì)胞密度，以1×105/孔接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)2 d后，按上述分組處理細(xì)胞，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，每孔用培養(yǎng)基洗3次，加入100 μL CCK8，混勻后置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h，采用全自動(dòng)酶標(biāo)免疫在450 nm處檢測各孔吸光度值。

流式細(xì)胞術(shù)：將細(xì)胞按1×105～2×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度2 mL接種于六孔板中，在6～12 h細(xì)胞貼壁后，按上述分組加入相應(yīng)的含血清培養(yǎng)基2 mL，再過48 h后，消化、離心收集細(xì)胞，采用FITC和PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況。

半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptional polymerase chain reaction, RT-PCR)：總RNA的提取參照Trizol說明書，依照紫外分光光度儀測定A260∶A280比值，重復(fù)3次，測得該比值穩(wěn)定于1.8～2.0，計(jì)算總RNA濃度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書制備cDNA模板。RT-PCR：以正常對照組和各個(gè)實(shí)驗(yàn)組Müller細(xì)胞第1鏈2 μL cDNA為模板，應(yīng)用AQP4特異性引物(上游：5′-GGAATTTCTGGCCATGCTTA-3′；下游：5′-AAGACAGACTTGGCGATGCT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)體系中均以β-actin作為內(nèi)參。PCR條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃變性30 s，60 ℃退火延伸45 s，循環(huán)28次，最后72 ℃總延伸7 min。以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測AQP4擴(kuò)增產(chǎn)物(231 bp)和β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物(240 bp)，將凝膠置凝膠成像系統(tǒng)攝像、分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Western印跡法：提取正常對照組和各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中Müller細(xì)胞總蛋白，采用紫外分光光度儀測定蛋白含量。各組取30 μg總蛋白，加入4×SDS上樣緩沖液(含10%β-巰基乙醇)，于沸水中加熱5 min，行SDS-PAGE(分離膠濃度為10%)。電泳結(jié)束后，進(jìn)行濕式電轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜(Millipore公司)，用含10%脫脂奶粉的TBST(含0.5%Tween-20)緩沖液室溫包被2 h；然后用抗AQP4抗體(1∶500)室溫孵育1 h后，4 ℃過夜；TBST漂洗5 min×5次，轉(zhuǎn)入HRP-抗兔IgG(1∶2 000)中；室溫孵育2 h，TBST漂洗5 min×5次，ECL發(fā)光、顯影、定影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。半定量分析通過測定目的條帶的吸光度值(A值)及β-actin吸光度值(a)，并計(jì)算(A/a) × 100%，定義為AQP4蛋白表達(dá)相對百分比(relative percentage)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 康柏西普對Müller細(xì)胞VEGF分泌的影響 應(yīng)用ELISA檢測細(xì)胞上清液中VEGF的濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1A所示，R2=0.998。高糖(25 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)的Müller細(xì)胞引起VEGF分泌增加(P<0.001)。低劑量(0.25 μg/mL)、中劑量(2.5 μg/mL)和高劑量(25 μg/mL)康柏西普顯著降低了Müller細(xì)胞VEGF的分泌(圖1B，P< 0.001)，表明康柏西普是Müller細(xì)胞分泌VEGF的高效拮抗劑。

圖1. ELISA檢測康柏西普處理Müller細(xì)胞對VEGF分泌的影響 A.標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2=0.998；B.VEGF檢測結(jié)果，#與正常對照組比較(P<0.001)，**示與高糖組比較(P<0.001)

2.2 康柏西普對Müller細(xì)胞活力的影響 如圖2所示，高糖處理后，Müller細(xì)胞活力明顯下降(P=0.011)，但低劑量(0.25 μg/mL)、中劑量(2.5 μg/mL)和高劑量(25 μg/mL)劑量康柏西普并未引起Müller細(xì)胞活力的明顯改變(P>0.05)，提示康柏西普對Müller細(xì)胞增殖或凋亡無顯著影響。進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡顯示：高糖引起Müller細(xì)胞凋亡百分比明顯增加(P=0.011)，但低劑量(0.25 μg/mL)、中劑量(2.5 μg/mL)和高劑量(25 μg/mL)康柏西普并未引起Müller細(xì)胞凋亡的顯著改變(P>0.05)(圖3)。

圖2. CCK8法檢測康柏西普對Müller細(xì)胞活力的影響 #示與正常對照組比較(P= 0.011)，但康柏西譜并未引起高糖狀態(tài)下Müller細(xì)胞活力的明顯改變(P>0.05)

圖3. 流式細(xì)胞術(shù)檢測康柏西普對Müller細(xì)胞凋亡的影響 A.正常對照組；B.高糖；C、D、E分別為康柏西普低劑量(0.25 μg/L)、中劑量(2.5 μg/L)和高劑量(25 μg/L)組；F.細(xì)胞凋亡率結(jié)果；#示與正常對照組比較(P=0.001)；但不同劑量的康柏西普并未引起高糖狀態(tài)下Müller細(xì)胞凋亡率的明顯改變(P>0.05)

2.3 康柏西普對Müller細(xì)胞表達(dá)AQP4-mRNA水平的影響 在正常對照組和各實(shí)驗(yàn)組中，采用RT-PCR法檢測AQP4在基因水平的表達(dá)變化(圖4A)，對其進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn)，高糖引起AQP4-mRNA表達(dá)增加(P=0.024)，低劑量(0.25 μg/mL，P<0.01)、中劑量(2.5 μg/mL，P<0.01)和高劑量(25 μg/mL，P<0.001)康柏西普分別不同程度地逆轉(zhuǎn)了高糖誘導(dǎo)的AQP4-mRNA表達(dá)上調(diào)(圖4B，P<0.01)。

2.4 康柏西普對Müller細(xì)胞表達(dá)AQP4蛋白水平的影響 在對照組和各實(shí)驗(yàn)組中，采用Western 印跡法檢測AQP4在蛋白水平的表達(dá)變化(圖5A)，對其進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn)，高糖引起AQP4表達(dá)增加(P=0.001)，低劑量(0.25 μg/mL，P=0.01)、中劑量(2.5 μg/mL，P<0.001)和高劑量(25 μg/mL，P<0.001)康柏西普分別不同程度地逆轉(zhuǎn)了高糖誘導(dǎo)的AQP4表達(dá)上調(diào)(圖5B)。

圖4. 半定量RT-PCR檢測康柏西普處理Müller細(xì)胞對AQP4-mRNA水平的影響 A.泳道1為正常對照組，2為高糖，3、4、5分別是康柏西普低劑量(0.25 μg/mL)、中劑量(2.5 μg/mL)和高劑量(25 μg/mL)組，β-actin為上樣對照；B.半定量結(jié)果，#示與正常對照組比較(P= 0.024)，與高糖組比較(*示P< 0.01，**示P< 0.001)

圖5. Western印跡法檢測康柏西普處理Müller細(xì)胞對AQP4水平的影響 A.泳道1為正常對照組，2為高糖，3、4、5分別是康柏西普低劑量(0.25 μg/mL)、中劑量(2.5 μg/mL)和高劑量(25 μg/mL)組，β-actin為上樣對照；B.半定量結(jié)果，#為與正常對照組比較(P= 0.001)，與高糖組比較(*示P=0.01，**示P< 0.001)

3 討論

DR引起的黃斑水腫是DR最常見的表現(xiàn)形式之一。眼內(nèi)新生血管生成是DR病情發(fā)展的重要標(biāo)志，VEGF及其受體在新生血管生成、血管分化及增加通透性等方面起重要作用[19]。

視網(wǎng)膜從組織來源與大腦相同，是一個(gè)高級的神經(jīng)組織。近年來大量研究證明，膠質(zhì)細(xì)胞直接參與視網(wǎng)膜的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持、功能調(diào)節(jié)和視網(wǎng)膜相關(guān)疾病的發(fā)生及發(fā)展[20]。Dubois-Dauphin等[21]在小鼠實(shí)驗(yàn)中，通過誘導(dǎo)Müller細(xì)胞凋亡導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和視網(wǎng)膜變性。Müller細(xì)胞的增生常發(fā)生在血-視網(wǎng)膜屏障(BRB)破壞之后，進(jìn)一步加劇血管功能障礙[5-6]。Müller細(xì)胞的增生可能是由于氧化應(yīng)激和多元醇通路的激活而啟動(dòng)，因?yàn)檫@些通路的藥理學(xué)抑制劑阻斷了中間絲蛋白膠質(zhì)細(xì)胞纖維酸性蛋白(GFAP)的上調(diào)[22-23]。在糖尿病患者和動(dòng)物模型的研究中均發(fā)現(xiàn)，Müller細(xì)胞數(shù)目增加以及功能活化[5-9]。此外，在DR中，Müller細(xì)胞也表現(xiàn)出神經(jīng)遞質(zhì)攝取和代謝失調(diào)[6, 24]，如在糖尿病患者和動(dòng)物模型的玻璃體和視網(wǎng)膜中檢測到谷氨酸濃度增加[6, 24]。過多的谷氨酸可能是糖尿病患者、動(dòng)物中視網(wǎng)膜電流下降和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的主要原因。

康柏西普是一種抗VEGF的融合蛋白，可以抑制病理性血管生成。2013年12月4日國家食品藥品監(jiān)督管理總局官網(wǎng)分布批準(zhǔn)康柏西普眼用注射液用于治療wAMD。該藥物系一種VEGF受體與人免疫球蛋白Fc段基因重組的融合蛋白，通過結(jié)合VEGF，競爭性抑制VEGF與受體結(jié)合并阻止VEGF家族受體激活，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生，達(dá)到治療wAMD的目的。通過近期臨床應(yīng)用的觀察，康柏西普對于wAMD的治療效果顯著。

由于康柏西普相關(guān)的基礎(chǔ)研究報(bào)道尚未查到，本實(shí)驗(yàn)所選的藥物劑量和時(shí)間參照同類抗VEGF藥物貝伐單抗、阿柏西普、雷珠單抗的實(shí)驗(yàn)確定的[25-28]。高糖可以刺激Müller 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF含量增加，提示高糖對于Müller細(xì)胞中VEGF分泌具有調(diào)控作用。孫雅彬等[29]研究發(fā)現(xiàn)，高糖可以促進(jìn)Müller細(xì)胞VEGF表達(dá)增加。這些研究提示，高糖能夠促進(jìn)Müller細(xì)胞VEGF的表達(dá)和分泌。我們發(fā)現(xiàn)，康柏西普處理顯著抑制了Müller細(xì)胞VEGF的分泌，并呈濃度依賴性。0.25 μg/mL的康柏西普處理使Müller細(xì)胞的VEGF水平降低了20倍之多，提示康柏西普是VEGF受體的高效拮抗劑。這可能是由于康柏西普與貝伐單抗、雷珠單抗等VEGF拮抗劑不同，它不僅作用于VEGF受體-1(VEGFR-1)，而且作用于VEGFR-2[15]。

Müller細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞是介導(dǎo)視網(wǎng)膜組織內(nèi)水轉(zhuǎn)運(yùn)的主要細(xì)胞。AQP可控制水在細(xì)胞的進(jìn)出。AQP4是一種雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要表達(dá)在血管周圍Müller細(xì)胞終板膜和內(nèi)界膜之內(nèi)。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，在DR、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等水腫的視網(wǎng)膜中出現(xiàn)AQP4異常分布，AQP4在視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞上，尤其是在玻璃體旁和環(huán)繞血管內(nèi)皮的Müller細(xì)胞足突上呈高表達(dá)。Da等[30]發(fā)現(xiàn)，AQP4基因缺失鼠比正常鼠視網(wǎng)膜水腫程度輕、損傷小，認(rèn)為AQP4參與視網(wǎng)膜水腫的發(fā)生。我們的研究發(fā)現(xiàn)，康柏西普處理高糖狀態(tài)下的Müller細(xì)胞明顯抑制了AQP4-mRNA和蛋白水平的表達(dá)，這與蔡維[27]和曾苗等[31]應(yīng)用貝伐單抗的研究結(jié)果一致。此外，高劑量的康柏西普(25 μg/mL)甚至?xí)垢咛菭顟B(tài)下Müller細(xì)胞AQP4-mRNA和蛋白水平的表達(dá)降低至正常狀態(tài)以下，提示在臨床上應(yīng)用康柏西普治療時(shí)劑量不宜太高，但有趣的是，這一劑量并沒有引起Müller細(xì)胞活力的顯著改變。

康柏西普能否用于糖尿病性視網(wǎng)膜水腫，目前罕見相關(guān)報(bào)道。我們建立了高糖Müller細(xì)胞模型來研究新型VEGF拮抗劑對Müller細(xì)胞功能的影響，旨在為臨床用藥提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?？蛋匚髌諏Ω咛菭顟B(tài)下的Müller細(xì)胞顯著抑制了VEGF的分泌，但對高糖處理引起的Müller細(xì)胞活力下降并無明顯改善?？蛋匚髌仗幚砻黠@抑制高糖誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞AQP4表達(dá)增加，并呈劑量依賴性，提示康柏西普可能通過降低Müller細(xì)胞AQP4的表達(dá)來緩解視網(wǎng)膜水腫。

[ 1 ] Good WV, Hardy RJ, Dobson V, et al.The incidence and course of retinopathy of prematurity: findings from the early treatment for retinopathy of prematurity study[J]. Pediatrics, 2005, 116(1): 15-23.

[ 2 ] 葛堅(jiān).眼科學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:305.

[ 3 ] Gupta N, Mansoor S, Sharma A, et al.Diabetic retinopathy and VEGF[J]. Open Ophthalmol J, 2013, 7: 4-10.

[ 4 ] Coorey NJ, Shen W, Chung SH, et al.The role of glia in retinal vascular disease[J]. Clin Exp Optom, 2012, 95(3): 266-281.

[ 5 ] Rungger-Br?ndle E, Dosso AA, Leuenberger PM. Glial reactivity, an early feature of diabetic retinopathy[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2000, 41(7): 1971-1980.

[ 6 ] Lieth E, Barber AJ, Xu B, et al.Glial reactivity and impaired glutamate metabolism in short-term experimental diabetic retinopathy. Penn State Retina Research Group[J]. Diabetes, 1998, 47(5): 815-820.

[ 7 ] Mizutani M, Gerhardinger C, Lorenzi M.Muller cell changes in human diabetic retinopathy[J]. Diabetes, 1998, 47(3): 445-449.

[ 8 ] Barber AJ, Antonetti DA, Gardner TW. Altered expression of retinal occludin and glial fibrillary acidic protein in experimental diabetes. The Penn State Retina Research Group[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2000, 41(11): 3561-3568.

[ 9 ] Ly A, Yee P, Vessey KA, et al.Early inner retinal astrocyte dysfunction during diabetes and development of hypoxia, retinal stress, and neuronal functional loss[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2011, 52(13): 9316-9326.

[10] 宋鄂, 董宇, 郝倩,等.VEGF與糖尿病視網(wǎng)膜病變早期的關(guān)系[J]. 中國實(shí)用眼科雜志. 2003,21(7): 537-541.

[11] 宋鄂, 董宇, 王浩東, 等.糖尿病視網(wǎng)膜病變早期血管內(nèi)皮生長因子作用機(jī)制的研究[J]. 中國病理生理雜志, 2004, 20(8): 1440-1443.

[12] Iandiev I, Pannicke T, Hollborn M, et al.Localization of glial aquaporin-4 and Kir4.1 in the light-injured murine retina[J]. Neurosci Lett, 2008, 434(3): 317-321.

[13] Rehak M, Hollborn M, Iandiev I, et al.Retinal gene expression and Muller cell responses after branch retinal vein occlusion in the rat[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2009, 50(5): 2359-2367.

[14] Li X, Xu G, Wang Y, et al.Safety and efficacy of conbercept in neovascular age-related macular degeneration: results from a 12-month randomized phase 2 study: AURORA study[J]. Ophthalmology, 2014, 121(9): 1740-1747.

[15] Wang Q, Li T, Wu Z, Wu Q, et al.Novel VEGF decoy receptor fusion protein conbercept targeting multiple VEGF isoforms provide remarkable anti-angiogenesis effect in vivo[J]. PLoS One, 2013, 8(8): e70544.

[16] Lu X, Sun X. Profile of conbercept in the treatment of neovascular age-related macular degeneration[J]. Drug Des Devel Ther, 2015, 9:2311-2320.

[17] 畢燃, 賈彩華, 于越, 等.康柏西普治療視網(wǎng)膜靜脈阻塞黃斑水腫的臨床觀察[J]. 赤峰學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2014，30(23): 71-73.

[18] Brown DM, Kaiser PK, Michels M, et al.Ranibizumab versus verteporfin for neovascular age-related macular degeneration[J]. N Engl J Med, 2006, 355(14): 1432-1444.

[19] Bacaj T, Tevlin M, Lu Y, et al.Glia are essential for sensory organ function in C. elegans[J]. Science, 2008, 322(5902): 744-747.

[20] Bringmann A, Pannicke T, Grosche J, et al. Müller cells in the healthy and diseased retina[J]. Prog Retin Eye Res, 2006, 25(4): 397-424.

[21] Dubois-Dauphin M, Poitry-Yamate C, de Bilbao F, et al.Early postnatal Muller cell death leads to retinal but not optic nerve degeneration in NSE-Hu-Bcl-2 transgenic mice[J]. Neuroscience, 2000, 95(1): 9-21.

[22] Baydas G, Tuzcu M, Yasar A, et al.Early changes in glial reactivity and lipid peroxidation in diabetic rat retina: effects of melatonin[J]. Acta Diabetol, 2004, 41(3): 123-128.

[23] Asnaghi V, Gerhardinger C, Hoehn T, et al.A role for the polyol pathway in the early neuroretinal apoptosis and glial changes induced by diabetes in the rat[J]. Diabetes, 2003, 52(2): 506-11.

[24] Li Q, Puro DG.Diabetes-induced dysfunction of the glutamate transporter in retinal Muller cells[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2002, 43(9): 3109-3116.

[25] Malik D, Tarek M, Caceres del Carpio J, et al.Safety profiles of anti-VEGF drugs: bevacizumab, ranibizumab, aflibercept and ziv-aflibercept on human retinal pigment epithelium cells in culture[J]. Br J Ophthalmol, 2014, 98(Suppl 1): 11-16.

[26] Deissler HL, Lang GK, Lang GE. Lang capacity of aflibercept to counteract VEGF-stimulated abnormal behavior of retinal microvascular endothelial cells[J]. Exp Eye Res, 2014, 122: 20-31.

[27] 蔡維.貝伐單抗對缺氧Müller細(xì)胞上水通道蛋白4表達(dá)的影響[D]. 武漢：華中科技大學(xué)，2011.

[28] 韓蔚. 抗血管內(nèi)皮生長因子Avastin對體外培養(yǎng)兔視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞生長的影響[D]. 蘇州：蘇州大學(xué)，2012.

[29] 孫雅彬, 王大廣, 宋鄂, 等.高糖對體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞增殖及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的影響[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2014，34(17): 4905-4907.

[30] Da T, Verkman AS. Verkman aquaporin-4 gene disruption in mice protects against impaired retinal function and cell death after ischemia[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2004, 45(12): 4477-83.

[31] 曾苗, 程揚(yáng), 曾水清.缺氧對視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞上水通道蛋白-4表達(dá)的影響[J]. 眼科研究, 2010, 28(3): 243-247.

(本文編輯 諸靜英)

·學(xué)術(shù)動(dòng)態(tài)·

第八屆亞洲神經(jīng)眼科大會(huì)暨第四屆全國神經(jīng)眼科學(xué)術(shù)會(huì)議通知

亞洲神經(jīng)眼科協(xié)會(huì)(ASNOS)于2002年在日本東京成立。由亞洲神經(jīng)眼科協(xié)會(huì)每兩年主辦一次的亞洲神經(jīng)眼科大會(huì)是一個(gè)大型國際神經(jīng)眼科會(huì)議，代表了亞洲神經(jīng)眼科基礎(chǔ)研究及臨床研究最高水平。歷屆會(huì)議都有數(shù)百名各國神經(jīng)眼科專業(yè)人士進(jìn)行學(xué)術(shù)交流，對國際最近神經(jīng)眼科新技術(shù)及學(xué)術(shù)前沿進(jìn)行介紹及討論。亞洲神經(jīng)眼科大會(huì)提供了一個(gè)國際化平臺(tái), 讓世界各地的參會(huì)者對前沿的神經(jīng)眼科研究課題交流想法, 探討最新進(jìn)展及促進(jìn)未來的合作。在亞洲神經(jīng)眼科大會(huì)中一個(gè)尤其出名且重要的病例討論版塊WalshinAsia，選取各國出色的帶病理結(jié)果的病例進(jìn)行深入剖析,非常具有挑戰(zhàn)性。

第八屆亞洲神經(jīng)眼科大會(huì)暨第四屆全國神經(jīng)眼科學(xué)術(shù)會(huì)議將于2015年10月22～25日在中國北京召開。本次會(huì)議將邀請國內(nèi)外著名的神經(jīng)眼科、眼科、神經(jīng)內(nèi)科及神經(jīng)外科等專家到會(huì)，就神經(jīng)眼科疾病在診斷學(xué)、遺傳學(xué)、影像學(xué)、流行病學(xué)、低視力康復(fù)等研究領(lǐng)域作專題介紹及神經(jīng)眼科病例討論。

此次會(huì)議是對我國神經(jīng)眼科的一次檢閱，也是與國際神經(jīng)眼科醫(yī)師交流學(xué)習(xí)的機(jī)會(huì)，歡迎全國醫(yī)師踴躍投稿參會(huì)。大會(huì)網(wǎng)址：www.2015asnos.com；大會(huì)郵箱：info@2015asnos.com；大會(huì)聯(lián)系人: 王京鳳13910114145，賴夢瑩18600288822。

熱忱期待您的參與！

第八屆亞洲神經(jīng)眼科大會(huì)組委會(huì)

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院第三屆神經(jīng)眼科培訓(xùn)班通知

第三屆復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院神經(jīng)眼科學(xué)習(xí)班將在十月金秋隆重舉辦，負(fù)責(zé)主辦這次學(xué)習(xí)班的王敏教授再次有幸邀請到美國愛荷華大學(xué)神經(jīng)眼科主任RandyKardon教授前來參加，還邀請到北京協(xié)和醫(yī)院眼科鐘勇教授，復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院放射科沙炎教授，眼科錢江教授、田國紅教授和復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科周磊醫(yī)生參與授課。本次內(nèi)容包括視神經(jīng)炎的診治與鑒別診斷、眼肌型重癥肌無力的診療策略、視乳頭疾病的診治思路、瞳孔測量儀在神經(jīng)眼科的應(yīng)用、相干光斷層掃描(OCT)血管成像在神經(jīng)眼科的應(yīng)用、神經(jīng)眼科疾病常見的OCT改變、眼眶疾病與神經(jīng)眼科和非動(dòng)脈炎性前段缺血性視神經(jīng)病變專家共識(shí)等。學(xué)習(xí)班將繼續(xù)秉承既往兩屆學(xué)習(xí)班的實(shí)用性，深入淺出地為學(xué)員帶來神經(jīng)眼科的最新資訊，結(jié)合病例討論和現(xiàn)場互動(dòng)，為各位同仁帶來不一樣的頭腦風(fēng)暴。讓一切變得簡單明了，神經(jīng)眼科不再神秘，這個(gè)秋天誠邀各位同仁再度聚首在復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院，一同享受這囊括了神經(jīng)眼科、神經(jīng)內(nèi)科和放射科的知識(shí)盛宴。會(huì)議地點(diǎn)：復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院門診6樓第二會(huì)議室；會(huì)議時(shí)間：2015年10月16～17日；會(huì)議開始時(shí)間：10月16日8:30。本次培訓(xùn)班不收取培訓(xùn)費(fèi)，會(huì)議免費(fèi)提供午餐。聯(lián)系人：陸萍老師；電話64377134-706。

王敏

Effects of conbercept on the growth of retinal Müller cells and the expression of aquaporin-4

CHENNian-jun,LIMing-xin.
DepartmentofOphthalmology,theAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221000,China

LI Ming-xin, Email: lmx216@vip.sina.com

Objective To investigate the effects of conbercept, a new vascular endothelial growth factor (VEGF) antagonist, on the growth of retinal Müller cells and the expression of aquaporin-4 (AQP4). Methods The cultured Müller cells were divided into 5 groups: normal control group, high glucose group (25 mmol/L glucose) and high glucose with conbercept treating groups at low (0.25 μg/mL), middle (2.5 μg/mL) and high (25 μg/mL) dose of conbercept treatment. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to investigate the VEGF secretion in the cell supernatant; CCK8 and flow cytometry were used to assess the cell growth; and semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and Western blot were used to detect the AQP4 expression. Results Conbercept treatments significantly inhibited the VEGF secretion of Müller cells under high glucose, but it did not rescue the high glucose-induced growth inhibition of Müller cells. Conbercept significantly reduced the increases of AQP4 expression in Müller cells that induced by high glucose treatment at a dose-dependent manner. Conclusions As a high-potent anti-VEGF drug, conbercept may alleviate retinal edema by down-regulating AQP4 expression, with no remarkable effects on Müller cell growth.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:318-323)

Conbercept; Müller cell; Aquaporin-4; Retinal edema

徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科 徐州 221000

李明新(Email:lmx216@vip.sina.com)

為徐州醫(yī)學(xué)院研究生院的在讀研究生、住院醫(yī)師 徐州 221000

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.05.005

2015-02-07)