李晨睿，孟志遠(yuǎn)，牛銀波，翟遠(yuǎn)坤，潘亞磊，謝　麗，梅其炳(西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院空間生物實(shí)驗(yàn)?zāi)M技術(shù)國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，陜西西安　710072)

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黃芩苷通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用

李晨睿，孟志遠(yuǎn)，牛銀波，翟遠(yuǎn)坤，潘亞磊，謝麗，梅其炳
(西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院空間生物實(shí)驗(yàn)?zāi)M技術(shù)國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710072)

中國圖書分類號(hào): R-332; R284.1; R329.24; R345.61; R394.2; R681; R977. 3

摘要:目的研究黃芩苷(baicalin)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat bone marrow derived mesenchymal stem cells，rBMSC)成骨分化過程中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響。方法采用貼壁篩選法體外培養(yǎng)rBMSC，給予黃芩苷3、5、7 d后，比

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2015－6－5 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.007.html

梅其炳(1953－)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:骨丟失發(fā)生機(jī)制及其藥物防護(hù)，通訊作者，Tel: 029-84779212，E-mail: qbmei@ nwpu.edu.cn較藥物處理組與對(duì)照組之間堿性磷酸酶(ALP)的活性。同時(shí)檢測(cè)給予黃芩苷對(duì)堿性磷酸酶陽性克隆和礦化結(jié)節(jié)形成的影響。提取總mRNA和總蛋白，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)黃芩苷對(duì)Wnt10a、GSK-3β、β-catenin以及LEF1 mRNA水平的影響。免疫印跡檢測(cè)藥物處理對(duì)β-catenin以及Runx2蛋白表達(dá)量的影響。結(jié)果黃芩苷明顯提高ALP的活性。10 μmol·L－1濃度的黃芩苷還可增加堿性磷酸酶克隆數(shù)和鈣化結(jié)節(jié)的形成。黃芩苷還可提高Wnt10a、β-catenin、GSK-3β、LEF1以及osteocalcin的mRNA水平，并提高β-catenin和Runx2的蛋白表達(dá)量。結(jié)論黃芩苷在0. 1～50 μmol·L－1的給藥濃度下可促進(jìn)rBMSC的成骨分化成熟，Wnt/β-catenin信號(hào)可能參與調(diào)控rBMSC的成骨分化。

關(guān)鍵詞:黃芩苷;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;成骨分化; Wnt/βcatenin信號(hào)通路;堿性磷酸酶

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)來源于骨髓，是具有自我更新及多向分化功能的細(xì)胞［1］。BMSCs的成骨分化能力隨年齡增加而減弱，并在微重力環(huán)境下被抑制，這可能是導(dǎo)致骨質(zhì)流失的重要原因之一［2－4］。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控BMSCs成骨分化的重要信號(hào)通路［5］。近年來研究表明，多種植物藥或天然藥物單體能有效防治骨質(zhì)疏松，如續(xù)斷、蛇床子素等［6－8］。黃芩為唇形科植物，富含黃酮類化合物，黃芩苷是其中的主要活性組分(化學(xué)結(jié)構(gòu)見Fig 1)。在不同結(jié)構(gòu)的36個(gè)黃酮類化合物中，黃芩苷對(duì)原代成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性促進(jìn)作用最為明顯，并且通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化［9］。然而，黃芩苷對(duì)rBMSC的成骨分化的作用及其分子機(jī)制還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以大鼠rBMSC為對(duì)象，研究黃芩苷對(duì)細(xì)胞增殖及成骨分化和成熟的影響，以及對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控。

Fig 1　Chemical structure of baicalin

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料體質(zhì)量220～250 g的Sprague-Dawley大鼠4只，購自中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物合格證號(hào): SCXK軍2007－007)。DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、青－鏈霉素及0.25% Trypsin-EDTA購自Thermo Scientific Hyclone公司。黃芩苷(純度≥99%)、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、MTT試劑、固藍(lán)RR、茜素紅、二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma-Aldrich公司。堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒購自南京建成生物工程研究所?？俁NA提取試劑盒(離心柱型)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量預(yù)混試劑均購自天根生化科技(北京)有限公司。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。β-catenin、Runx-2單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自Abcam公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)大鼠頸椎脫臼處死，于75%酒精中浸泡10 min，在無菌條件下快速分離股骨及脛骨，切除兩端骨骺，用5 mL注射器抽取一定量DMEM/F12培養(yǎng)液沖洗骨髓腔至液體澄清。收集沖洗液，用微量移液器吹打后靜置5 min。取上清液，于1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，用含10%體積分?jǐn)?shù)胎牛血清的DMEM/F12使細(xì)胞重懸，反復(fù)吹打后計(jì)數(shù)，以104個(gè)/cm2的密度接種于6孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3d后首次換液，每日觀察細(xì)胞生長情況，待貼壁細(xì)胞達(dá)80%融合后用胰酶進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)(此為第一代P1)。待細(xì)胞傳代至P3時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，96孔板、24孔板、6孔板接種密度為2×103、2 ×105、4×105細(xì)胞/孔。

1.2.2 ALP活性測(cè)定細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24h后進(jìn)行成骨性誘導(dǎo)(誘導(dǎo)培養(yǎng)液中抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松濃度分別為0. 284、10、2× 10－3mmol·L－1)。同時(shí)進(jìn)行給藥處理，系列黃芩苷終濃度為0. 1、0. 5、1、5、10、50 μmol·L－1，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。給藥組與對(duì)照組培養(yǎng)液均含有1‰的DMSO。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、5、7 d，每3 d換液1次。棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，每孔加入緩沖液和基質(zhì)液各50 μL，混勻于37℃水浴15 min，加入150 μL顯影液，于520 nm波長下測(cè)吸光度(OD)。根據(jù)試劑盒說明配制酚標(biāo)液標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)酚標(biāo)液及樣本的吸光度值計(jì)算酶活性，結(jié)果以每孔15 min內(nèi)產(chǎn)生酚的摩爾量表示。

1.2.3堿性磷酸酶陽性克隆(CFU-FALP)分析細(xì)胞接種于12孔板，培養(yǎng)24 h后成骨誘導(dǎo)，給藥組給予10 μmol·L－1黃芩苷，對(duì)照組加入空白誘導(dǎo)培養(yǎng)基，給藥組與對(duì)照組培養(yǎng)液均含有1‰的DMSO。7 d后采用偶氮偶合法進(jìn)行ALP組織化學(xué)染色。PBS 洗2遍，10%甲醛溶液固定1 min，加入基質(zhì)液(含0.1%的α-萘基磷酸鈉和固藍(lán)RR鹽的Michaelis氏巴比妥鈉-HCl緩沖液，pH 8.9)中反應(yīng)30 min。出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)時(shí)棄掉基質(zhì)液，PBS洗后固定，照相保存結(jié)果，用Image-Pro Plus 6.0軟件掃描CFU-FALP的面積、數(shù)量和灰度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.4礦化結(jié)節(jié)形成細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)24h后成骨誘導(dǎo)，給藥組給予10 μmol·L－1黃芩苷，對(duì)照組加入空白誘導(dǎo)培養(yǎng)基，給藥組與對(duì)照組培養(yǎng)液均含有1‰的DMSO。d12棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，10%甲醛固定5 min。加入茜素紅染色劑，37℃孵育1 h，觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況。照相保存結(jié)果，用Image-Pro Plus 6.0軟件掃描礦化結(jié)節(jié)的面積、數(shù)量和灰度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 Real time-qPCR分析細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24h后成骨誘導(dǎo)，給藥組給予10 μmol·L－1黃芩苷，對(duì)照組加入空白誘導(dǎo)培養(yǎng)基，給藥組與對(duì)照組培養(yǎng)液均含有1‰的DMSO。8、24、48 h后，按試劑盒方法提取總RNA，用超微量紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度，調(diào)整RNA濃度至1 μg，取1 μL逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在體系中加入引物(見Tab 1)和SYBR Green試劑，于Bio-Rad CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上，以兩步法對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。預(yù)變性階段，在95反應(yīng)10 min，一個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)階段，分別為95反應(yīng)15 s、57反應(yīng)30 s、72反應(yīng)30 s，共40個(gè)循環(huán)。記錄CT(cycle threshold)值，通過ΔΔCT =(CT目的基因－CT內(nèi)參基因)處理組－(CT目的基因－CT內(nèi)參基因)對(duì)照組，計(jì)算各組2－ΔΔCT，即得該目的基因給藥組mRNA表達(dá)與對(duì)照組mRNA的倍數(shù)。

Tab 1　Specific primer sequences for Real-time qPCR

1.2.6 Western blot分析細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后成骨誘導(dǎo)，給藥組給予1、10、50 μmol· L－1濃度黃芩苷，對(duì)照組加入空白誘導(dǎo)培養(yǎng)基，給藥組與對(duì)照組培養(yǎng)液均含有1‰的DMSO。處理3 d后，每孔用300 μL細(xì)胞裂解液(含有PMSF 1 mmol ·L－1)提取總蛋白。用超微量紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白濃度，加入含有溴酚藍(lán)的上樣緩沖液，于95℃變性5 min，經(jīng)12 % SDS-PAGE電泳分離后，將待測(cè)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5 %脫脂奶粉于室溫下?lián)u床封閉1 h，加入用TBST稀釋的β-catenin、Runx2、β-actin的一抗(稀釋比例為1∶1 000)，4℃過夜。次日用TBST將PVDF膜洗3次后，加入用TBST稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下?lián)u動(dòng)2 h。洗膜3次后，將發(fā)光液涂抹于PVDF膜上，于暗室曝光。將膠片進(jìn)行拍照，用IPP6.0軟件對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行測(cè)定，用相對(duì)定量進(jìn)行分析。

2　結(jié)果

2.1不同濃度黃芩苷對(duì)堿性磷酸酶活性的影響如Fig 2所示，rBMSC經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，ALP活性隨時(shí)間而增加，誘導(dǎo)7 d后ALP活性最高。不同濃度黃芩苷在5、7 d均能增加ALP活性(P＜0. 01)，并呈現(xiàn)出濃度依賴性，其中10 μmol·L－1黃芩苷對(duì)ALP活性增加最為明顯，而在50 μmol·L－1時(shí)ALP活性略有降低。

Fig 2　Effect of baicalin on ALP activityat various concentrations(n =6)*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs con

2.2黃芩苷對(duì)堿性磷酸酶活性陽性克隆形成的影響如Fig 3所示，rBMSC經(jīng)成骨誘導(dǎo)7 d后，對(duì)照組與給藥組均能形成堿性磷酸酶活性陽性克隆(CFU-FALP)。通過IPP 6.0軟件對(duì)進(jìn)行CFU-FALP灰度掃描(Tab 2)，給予黃芩苷1、10、50 μmol·L－1后，CFU-FALP的面積、數(shù)量和相對(duì)灰度高于對(duì)照組，且兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0. 05或P＜0. 01)。

Tab 2　Intensity scanning of CFU-FALPformation 7 days after osteogenic induction(n =4)

2.3黃芩苷對(duì)鈣化結(jié)節(jié)形成的影響如Fig 4所示，rBMSC經(jīng)成骨誘導(dǎo)12 d后，對(duì)照組與黃芩苷組均形成鈣化結(jié)節(jié)。給予黃芩苷1、10、50 μmol·L－1后，鈣化結(jié)節(jié)形成數(shù)量多于對(duì)照組。經(jīng)IPP6.0軟件分析(Tab 3)，鈣化結(jié)節(jié)的面積、數(shù)量和相對(duì)灰度高于對(duì)照組，且兩組間差異有顯著性(P＜0. 01)。

Fig 3　Effect of baicalin at various concentrations on CFU-FALPformation 7 daysafter osteogenic induction.A: CON，B: baicalin at 1μmol·L－1; C: baicalin at 10μmol·L－1; D: baicalin at 50 μmol·L－1

Fig 4　Effect of baicalin at various concentrations on mineralized nodule formation 12 days after osteogenic inductionA: CON; B: baicalin at 1 μmol·L－1; C: baicalin at 10 μmol· L－1; D: baicalinat 50 μmol·L－1

2.4黃芩苷對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響經(jīng)10μmol·L－1黃芩苷處理原代rBMSC 12、24、36 h后，Real time-qPCR檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路表達(dá)的變化，用相對(duì)定量法2－ΔΔCT分析檢測(cè)結(jié)果。如Tab4所示，給藥組在12、24、36 h均

Tab 3　Intensity scanning of mineralized nodule formation 12 days after osteogenic induction(±s，n =4)

Tab 3　Intensity scanning of mineralized nodule formation 12 days after osteogenic induction(±s，n =4)

AreaNumber Group/mm2·well－1/mineralized nodule·well－1Intensity CON　30.34±6.53 　702.78±49.50 　21955.34±2397.71 1 μmol·L－1　54.55±6.23＊＊　973.64±74.70＊＊　71181.98±5769.01＊＊10 μmol·L－1　68.14±4.93＊＊　1218.64±147.13＊＊　90613.62±6423.42＊＊50 μmol·L－1　64.03±5.41＊＊　1157.68±85.70＊＊　74511.73±5773.22＊＊*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs CON

Tab 4　Effect of baicalin at 10 μmol·L－1on mRNA expression of Wnt/β-catenin molecular 12，24，36 h after osteogenic differentiation(±s，n =3)

Tab 4　Effect of baicalin at 10 μmol·L－1on mRNA expression of Wnt/β-catenin molecular 12，24，36 h after osteogenic differentiation(±s，n =3)

Gene　12 h　24 h　36 h Wnt10a 　15.17±2.49＊＊　20.22±2.72＊＊　25.82±2.84＊＊GSK-3β 　2.68±0.32＊＊　4.61±0.24＊＊　9.65±0.04＊＊β-catenin 　4.50±0.07＊＊　4.15±0.30＊＊　5.14±0.16＊＊LEF1　3.47±0.03＊＊　3.43±0.87*　16.63±1.10＊＊＊Osteocalcin 　2.66±0.03＊＊　6.67±1.15＊＊　8.57±1.19＊＊*P＜0. 05;＊＊P＜0. 01 vs CON

可明顯提高Wnt10a、GSK-3β、β-catenin、LEF1和osteocalcin的基因表達(dá)量(P＜0. 05 or P＜0. 01)。其中黃芩苷在36 h對(duì)Wnt10a以及LEF1mRNA表達(dá)水平影響最為明顯，與同時(shí)間對(duì)照組相比，相對(duì)于管家基因GAPDH分別提高25. 82倍和16. 63倍。

2.5黃芩苷對(duì)β-catenin和Runx2蛋白表達(dá)量的影響經(jīng)1、10、50 μmol·L－1黃芩苷處理原代rBMSC 3 d后，采用Western blot檢測(cè)β-catenin和Runx2蛋白表達(dá)量。結(jié)果如Fig 5所示，黃芩苷僅在10 μmol·L－1濃度下能明顯提高Runx2的蛋白表達(dá)量，而黃芩苷在1、10、50 μmol·L－1的給藥濃度下均能提高β-catenin的蛋白表達(dá)量。

3　討論

近年來研究表明，植物藥在防治骨質(zhì)疏松方面具有巨大潛力。在傳統(tǒng)中藥方劑的基礎(chǔ)上開發(fā)和改良出多個(gè)抗骨質(zhì)疏松中成藥。Wang等［10］總結(jié)了12項(xiàng)抗骨質(zhì)疏松中成藥的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)并評(píng)價(jià)其有效性，受試者包括1 816名骨質(zhì)疏松患者。結(jié)果表明，受試中藥制劑都明顯增加了患者腰椎的骨密度。多種黃酮類化合物在細(xì)胞或動(dòng)物水平顯示出明顯促成骨作用，如淫羊藿苷、染料木黃酮、白藜蘆醇、蛇床子素等［10－14］。與傳統(tǒng)治療骨質(zhì)疏松藥物相比，植物藥來源廣泛且毒副作用較低，因此具有較大的應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。

Fig 5　Effect of baicalin at various concentrations on protein expression of β-catenin and Runx2 after osteogenic differentiation for 3 days*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs CON

BMSCs源于骨髓，具有自我更新及多向分化功能，在一定條件下能夠分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等［1］。促進(jìn)BMSCs的成骨分化，能夠增加骨形成及骨強(qiáng)度。近年來，應(yīng)用BMSCs對(duì)骨相關(guān)疾病進(jìn)行細(xì)胞治療引起極大關(guān)注，BMSCs在骨組織工程中也表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力［15－17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩苷能夠促進(jìn)BMSCs的成骨分化成熟，明顯提高ALP活性、ALP陽性克隆形成、鈣化結(jié)節(jié)形成，并提高Runx2基因及蛋白表達(dá)，所測(cè)定指標(biāo)均與細(xì)胞成骨分化密切相關(guān)。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)控BMSC成骨分化過程中發(fā)揮重要作用，但文獻(xiàn)報(bào)道有正、負(fù)調(diào)控兩種結(jié)果。轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt1、Wnt10a、Wnt10b及β-catenin 的ST2細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞ALP活性及鈣化能力明顯提高［5］。整體動(dòng)物水平，F(xiàn)ABP4-Wnt10b轉(zhuǎn)基因小鼠的骨量為野生型小鼠的4倍［18］。GSK-3α/β抑制劑603281-31-8能促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞的骨向分化［19］。C3H10T1/2細(xì)胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3A腺病毒載體后，通過上調(diào)CNN1/Cyr61表達(dá)增加其骨向分化［20］。然而Wnt3a抑制人BMSC的ALP活性并抑制其礦化［21－22］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不一致可能與采用的細(xì)胞類型及Wnt信號(hào)分子的水平高低密切相關(guān)。除了誘導(dǎo)BMSC分化，Wnt/β-catenin信號(hào)的過度激活能誘導(dǎo)BMSC衰老［23］。并且利用轉(zhuǎn)基因小鼠，在骨細(xì)胞持續(xù)激活β-catenin表達(dá)能夠明顯增加松質(zhì)骨骨量，但減弱骨力學(xué)性能［24］。因此，Wnt/β-catenin信號(hào)強(qiáng)弱對(duì)調(diào)控結(jié)果的影響，以及Wnt/β-catenin信號(hào)在不同細(xì)胞譜系、細(xì)胞周期所起的作用值得深入研究。

據(jù)報(bào)道，黃芩苷促進(jìn)成骨細(xì)胞分化并非通過雌激素信號(hào)通路發(fā)揮作用，而是通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)［7］。我們發(fā)現(xiàn)黃芩苷能夠提高Wnt10a、GSK-3β、β-catenin和LEF1的基因表達(dá)，并在蛋白水平提高β-catenin的表達(dá)量，表明黃芩苷可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)而促進(jìn)BMSCs的分化成熟。BMSCs的分化成熟是復(fù)雜的過程，在黃芩苷調(diào)控rBMSC成骨分化的過程中是否有其他Wnt/β-catenin信號(hào)分子或其他信號(hào)通路的參與還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

［1］Guan M，Yao W，Liu R，et al.Directing mesenchymal stem cells to bone to augment bone formation and increase bone mass［J］.Nat Med，2012，18(3): 456－62.

［2］Baker N，Boyette L B，Tuan R S.Characterization of bone marrow －derived mesenchymal stem cells in aging［J］.Bone，2015，70C: 37－47.

［3］張晨，呂東媛，孫樹津，等.地基微重力效應(yīng)模擬影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為及其調(diào)控機(jī)理研究進(jìn)展［J］.醫(yī)用生物力學(xué)，2014，29(3): 285－91.

［3］Zhang C，Lyu D Y，Sun S J，et al.Impacts of ground-based microgravity simulation on biological responses of bone marrow mesenchymal stem cells and its underlying mechnisms: a mini-review ［J］.J Med Biomechanics，2014，29(3): 285－91.

［4］Qian X，Zhang C，Chen G，et al.Effects of BMP-2 and FGF2 on the osteogenesis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in hindlimb unloaded rats［J］.Cell Biochem Biophys，2014，70(2): 1127－36.

［5］Cawthorn W P，Bree A J，Yao Y，et al.Wnt6，Wnt10a and Wnt10b inhibit adipogenesis and stimulate osteoblastogenesis through a β-catenin-dependent mechanism［J］.Bone，2012，50(2): 477－89.

［6］Li C R，Li Q，Liu R J，et al.Medicinal herbs in the prevention and treatment of osteoporosis［J］.Am J Chin Med，2014，42(1): 1－22.

［7］牛銀波，潘亞磊，李晨睿，等.續(xù)斷防治骨質(zhì)疏松的研究進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2013，29(7): 892－4.

［8］Niu Y B，Pan Y L，Li C R，et al.Research progress of Radix dipsaci in the prevention and treatment of osteoporosis［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29(7): 892－4.

［7］鮑君杰，謝梅林，朱路佳.蛇床子素治療去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(4): 591－2.

［8］Bao J J，Xie M L，Zhu L J.Treatment of osthol on osteoporosis inovariectomized rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(4): 591 －2.

［9］Guo A J，Choi R C，Cheung A W，et al.Baicalin，a flavone，induces the differentiation of cultured osteoblasts: an action via the Wnt/beta-catenin signaling pathway［J］.J Biol Chem，2011，286(32): 27882－93.

［10］Wang Z Q，Li J L，Sun Y L，et al.Chinese herbal medicine for osteoporosis: a systematic review of randomized controlled trails ［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013:356260.

［11］Zhai Y K，Guo X Y，Ge B F，et al.Icariin stimulates the osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells via activating the PI3K-AKT-eNOS-NO-cGMP-PKG［J］.Bone，2014，66: 189 －98.

［12］Yang L，Yu Z，Qu H，Li M.Comparative effects of hispidulin，genistein，and icariin with estrogen on bone tissue in ovariectomized rats［J］.Cell Biochem Biolhys，2014，70(1): 485－90.

［13］Durbin S M，Jackson J R，Ryan M J，et al.Resveratrol supplementation influences bone properties in the tibia of hindlimb-suspended mature Fisher 344×Brown Norway male rats［J］.Appl Physiol Nutrit Metabol，2012，37(6):1179－88.

［14］Zhai Y K，Pan Y L，Niu Y B，et al.The importance of the prenyl group in the activities of osthole in enhancing bone formation and inhibiting bone resorption in vitro［J］.Int J Endocrinal，2014，2014:921954.

［15］Bianco P，Cao X，F(xiàn)renette P S，et al.The meaning，the sense and the significance: translating the science of mesenchymal stem cells into medicine［J］.Nat Med，2013，19(1): 35－42.

［16］Guan M，Yao W，Liu R，et al.Directing mesenchymal stem cells to bone to augment bone formation and increase bone mass［J］.Nat Med，2012，18(3): 456－62.

［17］Ovares-Navarrete R，Hyzy S L，Haithcock D A，et al.Coordinated regulation of mesenchymal stem cell differentiation on microstructured titanium surfaces by endogenous bone morphogenetic proteins［J］.Bone，2015，73:208－16.

［18］Bennett C N，Longo K A，Wright W S，et al.Regulation of osteoblastogenesis and bone mass by Wnt10b［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(9): 3324－9.

［19］Kulkarni N H，Onyia J E，Zeng Q，et al.Orally bioavailable GSK-3alpha/beta dual inhibitor increases markers of cellular differentiation in vitro and bone mass in vivo［J］.J Bone Miner Res，2006，21(6): 910－20.

［20］Si W，Kang Q，Luu H H，et al.CCN1/Cyr61 is regulated by the canonical Wnt signal and plays an important role in Wnt3A-induced osteoblast differentiation of mesenchymal stem cells［J］.Mol Cell Biol，2006，26(8): 2955－64.

［21］De Boer J，Siddappa R，Gaspar C，et al.Wnt signaling inhibits osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells［J］.Bone，2004，34(5): 818－26.

［22］Boland G M，Perkins G，Hall D J，et al.Wnt 3a promotes proliferation and suppresses osteogenic differentiation of adult human mesenchymal stem cells［J］.J Cell Biochem，2004，93(6): 1210－30.

［23］Zhang D Z，Wang H J，Tan Y Z.Wnt/β-catenin signaling induces the aging of mesenchymal stem cells through the DNA damage response and the p53/p21 pathway［J］.PLoS One，2011，6(6): E21397.

［24］Chen S X，F(xiàn)eng J Q，Bao Q W，et al.Adverse effects of osteocytic constitutive activation of β-catenin on bone strength and bone growth［J］.J Bone Miner Res.doi: 10.1002/jbmr.2453，2015

Baicalin induces osteogenic differentiation of rat bone marrow derived mesenchymal stem cells via Wnt/β-catenin signaling pathway

LI Chen-rui，MENG Zhi-yuan，NIU Yin-bo，ZHAI Yuan-kun，PAN Ya-lei，XIE Li，MEI Qi-bing
(Key Laboratory for Space Bioscience and Biotechnology，School of Life Sciences，Northwestern Polytechnical University，Xi’an 710072，China)

Abstract:Aim To investigate the role of Wnt/β-catenin signaling pathway on the baicalin-induced osteogenic differentiation in rat bone marrow derived mesenchymal stem cells(rBMSC).Methods rBMSC was isolated and cultured by adherence screening method.Alkaline phosphatase(ALP)amount，CFU-FALP and mineralized nodules were compared between each baicalin group and vehicle control group at different time points.Real time q-PCR was employed to evaluate the mRNA level of Wnt signaling-related marker(Wnt10a，GSK-3β，β-catenin and LEF1)after baicalin treatment.Protein expression of β-catenin and Runx2 was measured by Western blot.Results Baicalin significantly increased ALP activities from day 3 to day 7.The formation of CFU-FALP and mineralized nodules remarkably increased after rBMSC was treated with1，10，50 μmol·L－1baicalin.mRNA levels of Wnt10a，β-catenin，GSK-3β，LEF1and osteocalcin were enhanced significantly in baicalin-treated group compared to control group.Protein expression of βcatenin and Runx2 was also elevated.Conclusion Baicalin(0. 1 to 50 μmol·L－1)promotes the osteogenic differentiation and maturation of rBMSC，in which Wnt/β-catenin signaling pathway might be involved.

Key words:baicalin; rat bone marrow derived mesenchymal stem cells(rBMSC); osteogenic differentiation; Wnt/β-catenin signaling pathway; alkaline phosphatase

作者簡介:李晨睿(1982－)，女，博士，博士后，研究方向:骨丟失發(fā)生機(jī)制及其藥物防護(hù)，E-mail: chenruilee525@126.com;

基金項(xiàng)目:中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(No 3102014JKY15009，3102014KYJD020)

收稿日期:2015－03－30，修回日期:2015－04－28

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978(2015)07－0919－06

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.007