盧麗莉　楊倩　仇艷玲　易力

GLT-1激動劑頭孢曲松鈉對慢性神經(jīng)病理性痛的影響

盧麗莉楊倩仇艷玲易力

【摘要】目的探討頭孢曲松鈉( Ceftriaxone，Cef)對慢性神經(jīng)病理性痛過敏及GLT-1表達(dá)的影響。方法雄性SD大鼠90只，隨機(jī)分為Sham組、CCI 14 d組、Cef預(yù)防組、Cef治療組，后2組設(shè)腹腔注射NS組為對照，在不同時(shí)間點(diǎn)測定熱縮足反射潛伏期;另設(shè)CCI 1 d、4 d、7 d組。應(yīng)用免疫組化觀察不同時(shí)間點(diǎn)脊髓后角GLT-1表達(dá)的變化。結(jié)果

CCI誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生了熱痛敏，腹腔注射NS對CCI誘導(dǎo)的熱痛敏無影響。Cef預(yù)防組大鼠CCI側(cè)后肢熱縮足反射潛伏期于CCI后第5天、第7天明顯延長( P＜0．05) ; Cef治療組大鼠CCI側(cè)后肢熱縮足反射潛伏期在術(shù)后第11天、第14天明顯延長( P＜0．05)。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，Cef預(yù)防組和Cef治療組分別抑制和逆轉(zhuǎn)了GLT-1在CCI后期表達(dá)的降低。結(jié)論Cef可通過上調(diào)GLT-1的表達(dá)對慢性神經(jīng)病理性痛起到預(yù)防和治療作用。

【關(guān)鍵詞】慢性神經(jīng)病理性疼痛;頭孢曲松鈉; GLT-1; CCI

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與脊髓水平傷害性信息的傳遞及痛覺過敏的形成［1］。由于胞外沒有谷氨酸的代謝酶，胞外谷氨酸的清除主要依靠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體［2］。目前已克隆出五種高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLAST ( EAAT1)、GLT-1 ( EAAT2)、EAAC1( EAAT3)、EAAT4和EAAT5［3－7］。眾多文獻(xiàn)表明，GLT-1在病理性痛和痛過敏的發(fā)生和維持中發(fā)揮重要作用。2005年Rothstein等［8］在《Nature》上報(bào)道，β-內(nèi)酰胺類抗生素(包括青霉素和一些新的衍生物)具有新的功能，其中頭孢曲松( Ceftriaxone，Cef)可增加GLT-1的表達(dá)和谷氨酸的攝取。但β-

內(nèi)酰胺類抗生素是否會對慢性神經(jīng)病性疼痛過程產(chǎn)生影響尚未報(bào)道。本研究觀察β-內(nèi)酰胺類抗生素Cef對CCI大鼠慢性神經(jīng)病理性痛過敏的影響，并觀察脊髓GLT-1表達(dá)的變化，為闡明GLT-1在病理性痛中的作用提供依據(jù)，為臨床上病理性痛的防治提供新線索與思路。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動物分組健康雄性Sprague-Dawley大鼠90只，體重( 280±20) g，將動物隨機(jī)分組: Sham組( n =10) :僅暴露坐骨神經(jīng)不進(jìn)行結(jié)扎;于術(shù)前1 d，術(shù)后第1天、3天、5天、7天、9天、11天、14天測定熱縮足反射潛伏期后，取材觀察GLT-1表達(dá)的變化。CCI 14 d組:行右側(cè)CCI，其他步驟同Sham組。另設(shè)CCI 1 d、CCI 4 d和CCI 7 d組觀察CCI后GLT-1表達(dá)的動態(tài)變化( n =10)。Cef預(yù)防( CCI + Cef 7)組( n =10) : 于CCI手術(shù)后當(dāng)天開始腹腔注射Cef，1次/d，共注射7次。于CCI術(shù)前1 d，術(shù)后第1天、3天、5天、7天觀察熱縮足反射潛伏期變化。完成上述程序后取材觀察GLT-1表達(dá)的變化。另設(shè)10只動物以相同程序腹腔注射NS為對照( CCI + NS 7)組。Cef治療( CCI + Cef 14)組( n =10) :于CCI手術(shù)后第7天開始腹腔注射Cef，1次/d，共注射7次。其他同Sham組。完成上述程序后取材觀察GLT-1表達(dá)的變化。另設(shè)10只動物以相同程序腹腔注射NS為對照( CCI + NS 14)組。

1．2熱縮足反射潛伏期的測定參照Bennett等［9］的方法制作CCI模型。應(yīng)用BME-410A型熱痛刺激儀(光源為12 V/35 W鹵素?zé)?進(jìn)行。測痛實(shí)驗(yàn)臺高36 cm，頂部為2 mm厚的石英玻璃板，將有機(jī)玻璃板制成的動物籠( 220 mm×220 mm×280 mm，無底，用有機(jī)玻璃隔板隔成3個(gè)23 cm×11 cm×28 cm的獨(dú)立空間)置于測痛實(shí)驗(yàn)臺頂部的石英玻璃板上，將待測動物置于籠內(nèi)，調(diào)節(jié)光源與石英玻璃板之間的距離，使落在足底的照射光圈直徑5 mm，記錄從開始照射至出現(xiàn)縮足逃避反射的時(shí)間( s)，作為熱刺激縮足潛伏期。重復(fù)測量5次，同一部位間隔10 min，不同部位間隔5 min，取平均值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)值。如大于30 s無反應(yīng)則停止照射，以免導(dǎo)致大鼠足底組織過熱損傷。

1．3取材、固定及免疫組化在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)，將動物迅速斷頭，取出腰5( L5)脊髓節(jié)段，將所取標(biāo)本置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后，連續(xù)橫截面切片，片厚約5 μm，石蠟切片經(jīng)二甲苯透明，常規(guī)梯度乙醇脫蠟，3%甲醇-過氧化氫，室溫下孵育15 min，10%血清工作液封閉抗原，豚鼠抗GLT-1抗體( 1∶1 000)，4℃冰箱過夜，生物素化二抗IgG(羊抗豚鼠1∶2 000)，37℃恒溫水浴鍋濕盒內(nèi)孵育60 min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃恒溫水浴鍋濕盒內(nèi)孵育50 min，DAB顯色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。每例動物隨機(jī)選取6張切片，于Olympus光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行定性觀察。應(yīng)用形態(tài)學(xué)圖象分析系統(tǒng)軟件(江蘇捷達(dá)，JEDA801D)進(jìn)行積分光密度( IOD)、平均光密度( AO)的測量。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11．5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以珋x±s表示，采用單因素方差分析( One-Way ANOVA)和t檢驗(yàn)( paried t-test)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2．1熱縮足反射潛伏期Sham組大鼠手術(shù)側(cè)后肢熱縮足反射潛伏期在所觀測的14 d內(nèi)均無明顯變化。CCI 14 d組大鼠CCI前熱縮足反射潛伏期在14 s左右，于CCI后第3天大鼠CCI側(cè)后肢熱縮足反射潛伏期開始下降，與Sham組比較明顯縮短( P＜0．05)。術(shù)后第5～7天下降到基礎(chǔ)值的55%左右，達(dá)最低值，一直持續(xù)到所測試的第14天。CCI + NS7組CCI側(cè)后肢熱縮足反射潛伏期與CCI組比較未見明顯變化，而Cef預(yù)防組大鼠CCI側(cè)后肢熱縮足反射潛伏期于CCI后第5天、第7天同NS對照組相比明顯延長。Cef治療組CCI側(cè)后肢熱縮足反射潛伏期在術(shù)后第11天、第14天與NS對照組比較明顯延長。未手術(shù)側(cè)后肢熱縮足反射潛伏期在所觀測的14 d內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)無明顯變化。見表1。

表1　大鼠熱縮足潛伏期n =10，x珋±s

2．2免疫組化脊髓后角GLT-1表達(dá)的變化CCI后脊髓后角GLT-1的表達(dá)出現(xiàn)先升高后降低的雙向性

變化。與Sham組比較，CCI后第1天和第4天脊髓后角淺層GLT-1的表達(dá)顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為IOD、AO值明顯增加( P＜0．05)。CCI后第7天和第14天脊髓后角淺層GLT-1的表達(dá)下降，表現(xiàn)為IOD、AO值明顯降低( P＜0．05)。Cef預(yù)防組GLT-1的表達(dá)較CCI + NS 7組顯著升高，表現(xiàn)為IOD、AO值增加( P＜0．05)，表明預(yù)先給予的Cef抑制了GLT-1在CCI后期表達(dá)的降低。Cef治療組GLT-1的表達(dá)較CCI + NS 7組顯著升高，表明GLT-1表達(dá)下降后再給予Cef逆轉(zhuǎn)了GLT-1表達(dá)的降低，表現(xiàn)為IOD、AO值的增加( P＜0．05)，而CCI + NS 7組GLT-1的表達(dá)同CCI 14 d組比較無明顯變化。見圖1。

圖1　腹腔注射0．9%氯化鈉溶液或頭孢曲松鈉后腰5脊髓后腳GLT-1表達(dá)的變化A: CCI + NS7組，B: CCI + Cef 7組，C: CCI + NS14組，D: CCI + Cef 14組(免疫組化×100)

3　討論

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的興奮性氨基酸，參與脊髓傷害性信息的傳遞。由于沒有谷氨酸代謝酶，所以胞外谷氨酸的攝取主要靠高效的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)［10，11］。許多研究表明調(diào)節(jié)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)和攝取對維持體內(nèi)谷氨酸的穩(wěn)態(tài)起重要的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，通過連續(xù)腹腔注射Cef 7 d后，Cef可通過血腦屏障進(jìn)入腦和脊髓，可以選擇性地誘發(fā)編碼GLT-1谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因轉(zhuǎn)錄，增加GLT-1的腦內(nèi)表達(dá)，并增強(qiáng)其功能活性［8］。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到CCI大鼠脊髓后角GLT-1的表達(dá)出現(xiàn)雙向性變化，術(shù)后第1天和第4天表達(dá)明顯升高，術(shù)后第7天和第14天表達(dá)減少。最初GLT-1的上調(diào)作為一種保護(hù)性的機(jī)制，攝取突觸間隙的谷氨酸，減少了這種過度激活導(dǎo)致的有害影響。有研究表明，神經(jīng)損傷后導(dǎo)致谷氨酸的釋放，可反饋性的引起GLT-1的上調(diào)［12］。隨后GLT-1下調(diào)。有人推測這種下調(diào)可能是由于失去了初級傳入引起的［12］，脊髓的退化性變化也對GLT-1的下調(diào)起到了一定作用。后期脊髓GLT-1的下調(diào)使脊髓谷氨酸在突觸間隙過多蓄積，結(jié)果導(dǎo)致谷氨酸受體的異常激活，是脊髓敏感化乃至痛覺過敏產(chǎn)生的重要機(jī)制［1］。這樣脊髓GLT-1的下調(diào)在慢性神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中起到了重要的作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到腹腔連續(xù)注射NS對CCI誘導(dǎo)的熱痛敏無影響，而預(yù)防性和治療性腹腔注射Cef 7 d后，發(fā)現(xiàn)CCI大鼠CCI側(cè)后肢熱縮足反射潛伏期同NS對照組比較明顯升高。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)腹腔注射NS后對GLT-1的表達(dá)無顯著影響，而腹腔注射Cef預(yù)防組和治療組的GLT-1表達(dá)與NS對照組比較均明顯增加。GLT-1表達(dá)的這種變化在其以上結(jié)果表明，腹腔注射Cef可以減輕CCI誘導(dǎo)的熱痛敏和機(jī)械性痛敏，并且使脊髓GLT-1表達(dá)增加。在病理性疼痛狀態(tài)下，阻斷脊髓谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的攝取后，可導(dǎo)致脊髓谷氨酸的過多蓄積，引起谷氨酸受體過度激活，產(chǎn)生自發(fā)性痛和痛覺過敏。腹腔注射Cef激動了GLT-1的表達(dá)，從而使脊髓細(xì)胞間隙內(nèi)的谷氨酸維持在低水平，減少谷氨酸受體的過度激活，從而抑制了熱痛敏和機(jī)械性痛敏的產(chǎn)生和發(fā)展。

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·論著·

項(xiàng)目來源:石家莊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目(編號: 131461223)

作者單位: 050011河北省石家莊市第三醫(yī)院病理科(盧麗莉、易力) ;河北省石家莊市第四醫(yī)院病理科(楊倩) ;河北省優(yōu)撫醫(yī)院老年病科(仇艷玲)

Effect of ceftriaxone on chronic neuropathic pain and the expression of GLT-1 in rats

LU Lili*，YANG Qian，QIU Yanling，et al．*Department of Pathology，The Third Hospital of Shijiazhuang City，Shijiazhuang 050011，China

【Abstract】Objective To investigate the effects of( Ceftriaxone，Cef) on chronic neuropathic pain and the expression of GLT-1 in rats．Methods Ninety male Spague-Dawley rats were randomly divided into sham-operation group，CCI 14d group，Cef prevention group，Cef therapy group，at the same time，the two groups with intraperitoneal injection with NS were designed as control groups for the last two groups．The thermal withdrawal latency was measured in different time points，in addition，CCI 1d，CCI 4d and CCI 7d groups were designed to observe dynamic change of GLT-1 expression after CCI．The changes of GLT-1 expression in dorsal horn of spinal cord were detected by immunohistochemistry．Results The thermal hyperalgesia in rats was induced by chronic crushing injury( CCI)，however，intraperitoneal injection with NS had no effect on thermal hyperalgesia induced by CCI．The thermal withdrawal latency was obviously prolonged in Cef prevention group on the 5th day，the 7th day after CCI( P＜0．05)，moreover，which in Cef therapy group was significantly prolonged on the 11th day，14th day after CCI( P＜0．05)．The results by immunohistochemisty showed that Cef prevention group and Cef therapy group inhibited and reversed the down-regulation of GLT-1 expression at CCI later period．Conclusion The Cef can prevent and treat chronic neuropathic pain by up-regulating the expression of GLT-1．

【Key words】chronic neuropathic pain; ceftriaxone sodium; GLT-1; CCI

收稿日期:( 2014－05－10)

doi:10．3969/j．issn．1002－7386．2015．04．004

【中圖分類號】R 441．1

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002－7386( 2015) 04－0494－03