劉印華　趙志強　李樹義　張慶波

黃芪多糖對免疫功能影響的體內(nèi)實驗研究

劉印華趙志強李樹義張慶波

【摘要】目的探討黃芪多糖對機體免疫功能的影響，從而為臨床應(yīng)用和相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。方法每批40只小鼠，隨機分為黃芪多糖組1(低劑量)，黃芪多糖組2(中等劑量)和黃芪多糖組3(高劑量)以及正常對照組，每組10只。黃芪多糖組每天灌服0．2 ml濃度為5、10、20 mg/ml的黃芪多糖溶液，正常對照組每天灌服0．2 ml 0．9%氯化鈉溶液，10 d后處死，取樣測定小鼠各項免疫指標(biāo)。固有免疫:檢測小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能;細(xì)胞免疫:小鼠后足遲發(fā)型超敏反應(yīng)強度;體液免疫:血凝法測定小鼠血清中溶血素含量;免疫器官:對脾臟和胸腺稱重計算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。結(jié)果黃芪多糖3組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)明顯高于正常對照組( P＜0．01) ;黃芪多糖3組小鼠左右后足重量差與正常對照組小鼠相比，有明顯提高( P＜0．01) ;黃芪多糖3組小鼠抗體積數(shù)高于正常對照組( P＜0．05) ;黃芪多糖3組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均較正常對照組小鼠有明顯提高( P＜0．01)。結(jié)論黃芪多糖可以顯著提高機體的固有免疫功能、細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能。

【關(guān)鍵詞】黃芪多糖;固有免疫;細(xì)胞免疫;體液免疫;免疫功能

黃芪桂枝五物湯出自《金匾要略·血痹虛勞病脈證治》，原文述“血痹陰陽俱微，寸口關(guān)上微，尺中小緊，外證身體不仁，如風(fēng)痹狀，黃芪桂枝五物湯主之?！睂儆跍亟?jīng)散寒劑，具益氣溫經(jīng)、和營通脈之功效，方由黃芪、白芍藥、桂枝、生姜、大棗五味藥組成。《金匱要略方論本義》:“黃芪桂枝五物湯，在風(fēng)痹可治，在血痹亦可治也。以黃芪為主固表補中，佐以大棗;以桂枝治衛(wèi)升陽，佐以生姜;以芍藥入營理血，共成厥美。”該方用藥精當(dāng)，組方嚴(yán)謹(jǐn)，長期以來備受中醫(yī)學(xué)者青睞，已成為臨證常用方劑之一。現(xiàn)代臨床應(yīng)用顯示，該方具有較廣泛的適應(yīng)癥和較好的臨床療效，已遠遠超越了原方“血痹”之見癥的范疇，尤其是在治療血液高粘滯綜合癥、頸椎病、微循環(huán)障礙和腦中風(fēng)后遺癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等方面收到滿意的療效。對復(fù)方中各單味藥化學(xué)成分及藥理作用研究，如:黃芪中含有的黃芪多糖、皂苷、黃酮等化合物具有較強的生物活性，黃芪皂苷主要作用于心腦血管，通過擴張血管達到降壓目的;黃芪多糖主要作用于多種免疫活性細(xì)胞，促進細(xì)胞因子的分泌和正常機體的抗體生成。桂枝的有效成分是揮發(fā)油，主要為桂皮醛和桂皮酸，可擴張血管，促進發(fā)汗、解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、利尿。但對黃芪桂枝五物湯中

的黃芪多糖進行系統(tǒng)的免疫學(xué)研究，目前筆者在國內(nèi)外尚未見文獻報道(河北省醫(yī)學(xué)情報研究所，查新編號: 13010520130618)。本項目采用黃芪多糖對小鼠進行體內(nèi)免疫學(xué)實驗研究，從而探明黃芪多糖的藥物作用機制，為臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1主要試劑:黃芪多糖由河北聯(lián)合大學(xué)藥學(xué)院提供。

1．1．2實驗動物:昆明小鼠40只: SPF級，雌雄各半，體重( 20±2) g，4～6周齡，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所(合格證編號: 0123883)。

1．2方法

1．2．1實驗動物分組:將每批次小鼠隨機分為4組:黃芪多糖組1(低劑量)、黃芪多糖組2(中等劑量)、黃芪多糖組3(高劑量)、和正常對照組，4組小鼠每組10只，雌雄各半。全部實驗小鼠進行適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d后，黃芪多糖組小鼠每天上午灌服0．2 ml濃度為5、10、20 mg/ml的黃芪多糖溶液1次，正常對照組小鼠每天上午灌服0．2 ml 0．9%氯化鈉溶液1次，連續(xù)10 d，次日處死采集樣本。根據(jù)實驗項目的具體要求進行免疫學(xué)檢測。

1．2．2巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定:采用半體內(nèi)法測定巨噬細(xì)胞吞噬功能。每只小鼠腹腔注射4%的淀粉溶液1 ml，24 h后每只小鼠腹腔注射10%雞紅細(xì)胞懸液1 ml，30 min后頸椎脫臼處死，固定于操作板上。腹腔注入2 ml 0．9%氯化鈉溶液，輕揉腹部1 min。無菌打開小鼠腹腔，吸出1 ml腹腔液，滴于潔凈載玻片上，37℃溫箱孵育30 min。0．9%氯化鈉溶液漂洗，去除未貼片細(xì)胞，晾干。甲醇溶液固定，Giemsa-磷酸鹽緩沖液染色20 min，蒸餾水漂洗，晾干。在光學(xué)顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞的吞噬情況，計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)，計算公式如下:

吞噬百分率=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)×100%

吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)

1．2．3遲發(fā)型超敏反應(yīng)測定:實驗小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，4組小鼠腹腔內(nèi)注射10% ( v/v)雞紅細(xì)胞( CRBC)懸液。處死前24 h每只小鼠左后足掌注射10% ( v/v) CRBC懸液50 μl，右后足掌注射等量0．9%氯化鈉溶液。24 h后處死小鼠，沿相同部位切下小鼠的雙后足，在電子天平上精確稱重，計算左右后足重量差。

1．2．4血清溶血素含量測定:血凝法檢測小鼠血清中溶血素含量。取小鼠血清，用0．9%氯化鈉溶液倍比稀釋，將不同稀釋倍數(shù)的血清分別加入微量血凝板內(nèi)，每孔100 μl。再加入100 μl新鮮制備的0．5% ( v/v)雞紅細(xì)胞懸液，充分混勻，置入濕盒內(nèi)加蓋，放置于37℃溫箱孵育30 min，觀察血凝板中雞紅細(xì)胞的凝集程度。血球凝集程度分為5級( 0～Ⅳ)，標(biāo)準(zhǔn)如下: 0 級:紅細(xì)胞全部下沉，在孔底部集中形成致密圓點狀，周圍液體清晰。Ⅰ級:紅細(xì)胞大部分沉集在孔底成圓點狀，周圍有少量凝集的紅細(xì)胞。Ⅱ級:凝集的紅細(xì)胞在孔底形成薄層，中心可以有一個明顯的疏松的紅點。Ⅲ級:凝集的紅細(xì)胞均勻的鋪散在孔底形成一薄層，中心隱約可見一個小紅點。Ⅳ級:凝集的紅細(xì)胞均勻的鋪散在孔底形成一薄層，凝塊有時可成卷折狀。

依據(jù)下列公式計算抗體積數(shù):

抗體積數(shù)= ( S1 +2S2 +3S3 +．．．．．．nSn)

公式中1、2、3．．．．．．n分別代表對倍稀釋的指數(shù)，S代表凝集程度的級別，抗體積數(shù)越大，表示小鼠體內(nèi)抗體水平越高。

1．2．5小鼠臟器指數(shù)測定:將小鼠處死，稱其體重，取脾臟和胸腺，電子天平分別稱重，計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

胸腺指數(shù)=胸腺重量( mg) /小鼠體重( g)

脾臟指數(shù)=脾臟重量( mg) /小鼠體重( g)

1．3統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件，計量資料以珋x±s表示，組間比較采用方差分析及q檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2．1巨噬細(xì)胞吞噬功能比較采用半體內(nèi)法測定巨噬細(xì)胞吞噬功能，能反映機體固有免疫功能狀態(tài)。結(jié)果顯示，黃芪多糖組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)均顯著高于正常對照組( P＜0．01)。見表1。

表1　4組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)比較

2．2后足遲發(fā)型超敏反應(yīng)強度比較小鼠左右后足重量差越大，表示遲發(fā)型超敏反應(yīng)引起的炎性反應(yīng)強度越大，小鼠機體內(nèi)細(xì)胞免疫功能越強。結(jié)果顯示:與正常對照組相比，黃芪多糖組左右后足重量差顯著提高( P＜0．01)。見表2。

2．3血清溶血素含量比較血清溶血素含量能反映

機體的體液免疫功能狀態(tài)，結(jié)果顯示，黃芪多糖組抗體積數(shù)顯著高于正常對照組抗體積數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0．05)。見表3。

表2　4組小鼠左右后足重量差比較n =10，g，珋x±s

表3　4組小鼠抗體積數(shù)比較　n =10，珋x±s

2．4臟器指數(shù)比較機體受抗原刺激后，會發(fā)生免疫反應(yīng)，即淋巴細(xì)胞活化增殖，免疫器官的重量增加，免疫功能增強。結(jié)果顯示，黃芪多糖組與正常對照組相比脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著增高( P＜0．01)。見表4。

表4　4組小鼠小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的比較

注:與對照組比較，*P＜0．01

3　討論

黃芪是一種補益類中藥，生物活性很強，臨床已經(jīng)大量應(yīng)用其中藥制劑，其中黃酮、皂苷、黃芪多糖等幾種化學(xué)物質(zhì)為黃芪的主要有效成份，也是發(fā)揮生物活性的成份。黃芪多糖主要作用于多種免疫活性細(xì)胞，促進細(xì)胞因子的分泌和正常機體的抗體生成。對于黃芪的應(yīng)用，早有黃芪桂枝五物湯，方劑出自《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治》，原文述“血痹陰陽俱微，寸口關(guān)上微，尺中小緊，外證身體不仁，如風(fēng)痹狀，黃芪桂枝五物湯主之”。屬于溫經(jīng)散寒劑，具益氣溫經(jīng)、和營通脈之功效，方由黃芪、白芍、桂枝、生姜、大棗五味藥組成。《金匱要略方論本義》記載“黃芪桂枝五物湯，在風(fēng)痹可治，在血痹亦可治也。該方用藥精當(dāng)，組方嚴(yán)謹(jǐn)，備受中醫(yī)學(xué)者青睞，已成為臨證常用方劑之一。

目前，多糖的生物學(xué)作用越來越引起人們的重視，孟巖等［1］研究了酵母多糖對肉雞生長性能和腸黏膜形態(tài)的影響，侯建明等［2］報道了銀耳多糖對免疫功能影響，楊鐵虹等［3］探討了當(dāng)歸多糖對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，張建峰等［4］研究了紅曲多糖的免疫活性，但黃芪多糖對機體免疫功能影響的系統(tǒng)深入研究目前尚未見文獻報道。

機體的免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子組成，免疫功能是在免疫細(xì)胞和免疫分子相互作用下完成的，免疫系統(tǒng)根據(jù)對抗原的免疫識別而發(fā)揮作用。免疫可分為固有免疫和適應(yīng)性免疫，固有免疫又稱為非特異性免疫或天然免疫;適應(yīng)性免疫又稱為特異性免疫或獲得性免疫，由體液免疫( B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫)和細(xì)胞免疫( T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫)組成。巨噬細(xì)胞是機體固有免疫的主要細(xì)胞之一，在固有免疫和適應(yīng)性免疫中均起重要作用，具有吞噬、殺傷、提呈抗原、分泌生物活性物質(zhì)、調(diào)控機體免疫以及抑制腫瘤等多種功能［5－7］。遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的強度，能較好的體現(xiàn)機體的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)［8］，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的增加表明細(xì)胞免疫功能的增強?？贵w是機體殺滅病原菌和清除外來抗原的重要免疫活性物質(zhì)，體內(nèi)抗體的含量是機體體液免疫功能狀態(tài)的標(biāo)志，體內(nèi)抗體含量的增加說明體液免疫功能的增強。脾臟和胸腺為小鼠重要的免疫器官，主要由免疫細(xì)胞構(gòu)成，其重量是免疫功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。當(dāng)免疫器官的重量增加，其相對于體重的比值即增加，用臟器指數(shù)表示。臟器指數(shù)的變化，能夠反映機體免疫功能的狀態(tài)［9，10］。

本研究結(jié)果顯示:與正常對照組相比較，黃芪多糖組的小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能增強;左右后足重量差增大，即遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)引起的炎性反應(yīng)強度變大;血清中溶血素含量增加;脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)都有所提高;說明黃芪多糖通過對機體非特異性免疫、特異性免疫及免疫器官等作用，從而增強機體免疫功能。

參考文獻

1孟巖，張輝．酵母多糖對肉雞生長性能和腸黏膜形態(tài)的影響．中國飼料，2007，21: 30-32．

2侯建明，王愛東，雷清新，等．銀耳多糖對免疫功能影響的實驗報告．中國療養(yǎng)醫(yī)學(xué)，2007，16: 641-643．

3楊鐵虹，賈敏，梅其炳．當(dāng)歸多糖對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用．中成藥，2007，5: 563-565．

4張建峰，昌友權(quán)，陳光，等．紅曲多糖的免疫活性研究．食品科學(xué)，2009，29: 391-393．

5Dvorak RA．Effects of Bio-Mos，F(xiàn)OS and Carbadox on Del’-formance of pigs Days 0-21 postweaning．J Anim Sci，1998，32: 95-98．

6陳小兵，丁宏標(biāo)，喬宇．酵母多糖的益生作用、免疫機制與應(yīng)用技術(shù)．中國畜牧獸醫(yī)，2005，32: 6-8．

7Peter Spring．糖類在微生物中的作用．中國畜牧獸醫(yī)，2006，33: 1-2．

8田維毅，楊娟，王平．四物湯等復(fù)方多糖組分對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的影響．中華中醫(yī)藥雜志，2009，24: 515-517．

9祁林，劉麗芳．黃丹凝膠抗炎及免疫抑制的實驗研究．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26: 1007-1009．

10高天蕓，孫玉芹，周娟，等．黃芩苷對化療藥物所致小鼠免疫低下的調(diào)節(jié)作用．中國生化藥物雜志，2007，28: 327-329．

·論著·

項目來源:唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃(編號: 13130253z)

作者單位: 063305河北省南堡鹽場醫(yī)院(劉印華) ;河北聯(lián)合大學(xué)(趙志強、李樹義、張慶波)

Effects of Astragalin polysaccharides on immune function in vivo

LIU Yinhua*，ZHAO Zhiqiang，LI Shuyi，et al．*Nanpu Salt Factory Hospital，Hebei，Tangshan 063305，China

【Abstract】Objective To investigate the effects of Astragalin polysaccharides on immune function of mice in order to provide theoretical basis for clinical application．Methods Forty mice were randomly divided into four groups: low-dose Astragalin polysaccharide group，median-dose Astragalin polysaccharide group，high-dose Astragalin polysaccharide group and normal control ( NC) group，with 10 mice in each group．The mice in Astragalin polysaccharide groups were given Astragalin polysaccharides 0．2ml by gavage ( 5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml，respectively) per day，however，the mice in NC group were given 0．9% sodium chloride solution 0．2ml by gavage per day．After 10 days，the mice were sacrificed without pain and the specimens were collected from them．The immune function parameters of the mice were examined as follows: ( 1) Innate immune: macrophage phagocytosis was detected; ( 2) Cellular immune: delayed hypersensitivity intensity was tested; ( 3) Humoral immune: hemolysin content in serum was examined by hemagglutination test; ( 4) Immune organ: spleen and thymus indexes were calculated by weighting．Results The phagocyte rate and phagocyte indexes in the three Astragalin polysaccharide groups were significantly higher than those in NC group ( P＜0．01)．As compared with that in NC group，the weight difference between left and right postpedes in Astragalin polysaccharide groups was significantly improved ( P＜0．01)．The antibody titre in Astragalin polysaccharide groups was significantly higher than that in NC group ( P＜0．05)．As compared with those in NC group，the spleen and thymus indexes in Astragalin polysaccharide groups were significantly increased ( P＜0．01)．Conclusion Astragalin polysaccharides can obviously enhance immune function of organism including innate immune，humoural immune and cellular immune．

【Key words】Astragalin polysaccharides; innate immune; cellular immune; humoral immune; immune function

收稿日期:( 2014－08－10)

doi:10．3969/j．issn．1002－7386．2015．04．001

【中圖分類號】R 343．9

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002－7386( 2015) 04－0485－03