張劍虹　張飛　張曉麗　孫忠哲

Cox-2、nm23和MMP-3在直腸小細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

張劍虹張飛張曉麗孫忠哲

【摘要】目的探討直腸小細(xì)胞癌Cox-2、nm23和MMP-3的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法及組織芯片技術(shù)，觀察63例直腸小細(xì)胞癌Cox-2、nm23和MMP-3的表達(dá)情況。結(jié)果Cox-2、MMP-3陽性表達(dá)率與直腸小細(xì)胞癌的浸潤深度、腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，隨浸潤深度加深，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率增加而升高( P＜0．05)。Cox-2、MMP-3陽性表達(dá)率與直腸小細(xì)胞癌的TNM分期無關(guān)( P＞0．05)，nm23蛋白的陽性表達(dá)與腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期有關(guān)，隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期的增加而減低( P＜0．05)，與浸潤深度無關(guān)( P＞0．05)。Cox-2、nm23和MMP-3的表達(dá)與患者年齡、性別無關(guān)( P＞0．05)。結(jié)論直腸小細(xì)胞癌的nm23、Cox-2和MMP-3的表達(dá)與臨床預(yù)后密切相關(guān)，聯(lián)合檢測可預(yù)測直腸小細(xì)胞癌的惡性程度及判斷預(yù)后。

【關(guān)鍵詞】環(huán)氧合酶;基質(zhì)金屬蛋白酶;組織芯片;免疫組化;直腸小細(xì)胞癌

直腸小細(xì)胞癌惡性度高，侵襲性強(qiáng)，常侵達(dá)壁漿膜外及遠(yuǎn)隔器官，其轉(zhuǎn)移機(jī)制不清，癌細(xì)胞的侵襲性與新血管的生成，細(xì)胞外基質(zhì)降解等因素密切相關(guān)。環(huán)氧合酶( Cox-2)在細(xì)胞的凋亡和腫瘤發(fā)生中起一定作用;腫瘤抑制基因( nm23)與多種惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān);基質(zhì)金屬蛋白酶( MMP-3)通過參與降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜參與直腸小細(xì)胞癌的發(fā)生，發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法及組織芯片技術(shù)，觀察Cox-2、nm23和MMP-3在63例直腸小細(xì)胞癌中表達(dá)，研究癌細(xì)胞的浸潤，轉(zhuǎn)移分子機(jī)制，為臨床治療提供相關(guān)依據(jù)。

1　資料與方法

1．1一般資料選取河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院

2010年1月至2012年10月手術(shù)后經(jīng)病理診斷為直腸小細(xì)胞癌標(biāo)本63例，其中男28例，女35例;年齡34～75歲，平均54．5歲;≥50歲41例，＜50歲22例;浸潤深度未侵及漿膜26例，侵及漿膜37例;有腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，無腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例;按TNM標(biāo)準(zhǔn)分類，Ⅰ+Ⅱ期27例，Ⅲ+Ⅳ期36例，所有病例均無手術(shù)斷端腫瘤殘留。

1．2標(biāo)本處理及診斷所有標(biāo)本術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療及免役治療，手術(shù)切除新鮮直腸小細(xì)胞癌標(biāo)本，經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚連續(xù)切片，兩位有經(jīng)驗(yàn)病理醫(yī)師顯微鏡下診斷為黏液腺癌。

1．3組織芯片制備組織芯片委托試劑公司在天津腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所完成，過程如下:組織載玻片經(jīng)過夜泡酸，充分清洗并烘干，用多聚賴氨酸行防脫片處

理，對每一組織標(biāo)本，觀察HE切片，選取目標(biāo)組織并在HE切片及其相應(yīng)石蠟組織塊(供體蠟塊)上標(biāo)記，萊卡石蠟空白蠟塊(受體蠟塊)與蜂蠟混合(比例為1∶1)，制成2．2 cm×3．5 cm×1 cm大小蠟塊，用加拿大生產(chǎn)CDX718組織芯片儀打孔制成帶孔空白蠟塊，將蠟塊放在39～42℃水浴中軟化后，用組織芯片儀從供體蠟塊標(biāo)記部位逐個(gè)取出直徑1 mm高4 mm的組織柱，推入空白蠟塊預(yù)先設(shè)計(jì)的相應(yīng)孔內(nèi)，這樣在空白蠟塊上制作完成了68個(gè)組織芯片，為防止染色過程中脫片，每例標(biāo)本上樣四個(gè)點(diǎn)，分別安插在空白蠟塊1和2中，對蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，裱于防脫片處理的載玻片上。

1．4免疫組織化學(xué)染色nm23、Cox-2、MMP-3抗體濃縮液均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，按不同比例稀釋后進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇最佳稀釋比例。應(yīng)用免疫組化S-P法進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過程均由同一病理技師操作完成，梁色步驟:石蠟切片常規(guī)脫蠟，水化，加3%過氧化氫甲醇溶液50 μl，阻斷過氧化物酶后，加熱修復(fù)抗原10 min，加10%正常山羊血清封閉，室溫溫育10 min，加第一抗體，室溫溫育120 min，加生物素標(biāo)記的第二抗體50 μl，室溫溫育10 min，加辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素溶液50 μl，，室溫溫育10 min，加新鮮配制DAB溶液100 μl顯色。以上各步驟之間均用緩沖液沖洗3次，共15 min，蘇術(shù)精對比染色、脫水、透明、封固，鏡下觀察。

1．5陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)陽性結(jié)果判斷根據(jù)以下兩方面的總分進(jìn)行判斷: ( 1)選染色均勻的陽性表達(dá)區(qū)域，5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，以陽性細(xì)胞所占百分比為5級計(jì)分:陽性細(xì)胞率＜5%為0分;陽性細(xì)胞率5%～25%為1分;陽性細(xì)胞率26%～50%為2分;陽性細(xì)胞率51%～75%為3分，陽性細(xì)胞率＞75%為4分。( 2)按染色強(qiáng)度來分:不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。兩種評分相加，0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性( + )，4～5分為陽性( + + )，6～7分為強(qiáng)陽性( + + + )，以上方法均由2名有經(jīng)驗(yàn)的高年資病理醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立檢測，取平均值。Cox-2的表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜出血棕黃色顆粒為陽性，MMP-3的表達(dá)以細(xì)胞核出現(xiàn)棕色為陽性。光鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野，當(dāng)陽性染色癌細(xì)胞≤25%定為陰性表達(dá)，＞25%定為陽性表達(dá)。

1．6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 6．12統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)和線性相關(guān)分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2．1Cox-2在直腸小細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系在直腸小細(xì)胞癌組織中表達(dá)的陽性率為57．14%( 36/63)，分布特點(diǎn): Cox-2陽性細(xì)胞可見細(xì)胞漿內(nèi)淺-棕黃色顆粒，密度較均勻，與血管走行無規(guī)律性。Cox-2陽性在直腸小細(xì)胞癌侵及漿膜和未見侵及漿膜2組間比較(χ2= 6．31，P＜0．05) ;腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和未見轉(zhuǎn)移2組間比較(χ2= 9．81，P＜0．05)。Cox-2陽性表達(dá)率隨直腸小細(xì)胞癌浸潤深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加而升高。Cox-2在直腸小細(xì)胞癌中陽性表達(dá)與TNM分期無相關(guān)性( P＞0．05)。見表1、圖1。

2．2nm23在直腸小細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系nm23在直腸小細(xì)胞癌組織中陽性表達(dá)率為49．21%( 31/63)，分布特點(diǎn): nm23陽性細(xì)胞可見細(xì)胞漿淺-黃色顆粒，與血管走行無規(guī)律性，密度分布不均勻。nm23陽性率在腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和未見轉(zhuǎn)移2組間比較(χ2=6．99，P＜0．05)，在TNM分期Ⅲ+Ⅳ期與Ⅰ+Ⅱ期組間比較(χ2= 8．47，P＜0．05)。nm23陽性率隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期的增加而降低。nm23陽性率與浸潤深度無相關(guān)性( P＞0．05)。見表1，圖2。

2．3MMP-3在直腸小細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系MMP-3在直腸小細(xì)胞癌組織中表達(dá)的陽性率為61．90% ( 39/63)，分布特點(diǎn): MMP-3陽性細(xì)胞可見細(xì)胞漿淺-黃色顆粒，與血管走行無規(guī)律性，密度分布較均勻。MMP-3侵及漿膜和未見侵及漿膜2組間比較(χ2= 6．02，P＜0．05) ;腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和未見轉(zhuǎn)移2組間比較(χ2=5．64，P＜0．05)。MMP-3陽性表達(dá)隨浸潤深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加而升高。MMP-3陽性表達(dá)與TNM分期無相關(guān)性( P＞0．05)。見表1，圖3。

2．4Cox-2、nm23、MMP-3的陽性表達(dá)率與直腸小細(xì)胞癌患者的年齡，性別的關(guān)系Cox-2、nm23、MMP-3的陽性表達(dá)率與直腸小細(xì)胞癌患者的年齡、性別的關(guān)系無關(guān)( P＞0．05)。見表1。

3　討論

直腸小細(xì)胞癌惡性度高，容易局部侵襲，淋巴道擴(kuò)散及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后差，探索其轉(zhuǎn)移機(jī)制十分必要。腫瘤較強(qiáng)的增殖，侵襲特性與腫瘤細(xì)胞分裂旺盛，細(xì)胞間黏附力改變，降解基質(zhì)及微血管新生等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)分別研究Cox-2、nm23和MMP-3與直腸小細(xì)胞癌的生物學(xué)行為的相關(guān)性。

環(huán)氧合酶( cyclooxygenase，COX)又稱為環(huán)氧化酶和PG內(nèi)過氧化物合成酶。是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素( PG)合成過程中的一個(gè)關(guān)鍵限速酶。高含

量的PG可加速腫瘤組織增值、侵襲、轉(zhuǎn)移。Cox-2可通過刺激腫瘤細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞免役功能等促進(jìn)癌前病變向腫瘤轉(zhuǎn)化，可以通過促進(jìn)脈管形成參與浸潤，轉(zhuǎn)移。Cox-2可通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)來增加腫瘤血管的生成，生長，侵襲。Cox-2在細(xì)胞的凋亡和腫瘤發(fā)生中起一定作用。近年發(fā)現(xiàn)多器官惡性腫瘤均有Cox-2的高表達(dá)。羅瓊等［1］發(fā)現(xiàn)Cox-2在卵巢癌中的表達(dá)明顯高于卵巢良性腫瘤和正常卵巢組織，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。張帥等［2］發(fā)現(xiàn)具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌的Cox-2表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織。本研究檢測了63例直腸小細(xì)胞癌Cox-2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)浸潤至漿膜層的Cox-2表達(dá)率為70．27%，與未浸潤至漿膜組的病例相比( 38．46%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0．05) ;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Cox-2表達(dá)率為75．76%，顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組( 36．67%)，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0．05)。顯示Cox-2高表達(dá)的病例腫瘤細(xì)胞生長快，不易凋亡，Cox-2通過誘導(dǎo)腸壁肌層-漿膜層等腫瘤內(nèi)小血管的新生，使癌細(xì)胞容易浸潤。Cox-2蛋白的高表達(dá)可促進(jìn)癌組織的快速增殖，向遠(yuǎn)隔器官的播散及淋巴道的轉(zhuǎn)移，Cox-2可作為預(yù)后不良的參考因素。

圖1　直腸小細(xì)胞癌的Cox-2的表達(dá)( SP× 200)

圖2　直腸小細(xì)胞癌的nm23的表達(dá)( SP× 200)

圖3　直腸小細(xì)胞癌的MMP-3的表達(dá)( SP× 200)

表1　Cox-2、nm23、MMP-3在直腸小細(xì)胞癌組織中的

nm23基因是近年來發(fā)現(xiàn)并被證實(shí)與多種腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的腫瘤抑制基因，現(xiàn)已檢測出三種亞型: nm232H1、nm232H2、nm232H3。主要是nm232H1發(fā)揮作用，其表達(dá)與多種惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)。nm23的作用機(jī)制包括:作為一種分泌蛋白，具有細(xì)胞因子的功能，介導(dǎo)細(xì)胞吞噬功能及運(yùn)動(dòng)活性，并調(diào)節(jié)細(xì)胞正常發(fā)育和分化。nm23的同源基因awd參與CTP激活蛋白的作用，awd的突變或表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致異常分化，廣泛畸形及癌變，甚至在前蛹期死亡［3］。高艷等［4］發(fā)現(xiàn)隨結(jié)腸癌浸潤的加深，其陽性表達(dá)逐漸降低，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的陽性表達(dá)較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著降低。本研究中我們檢測了63例直腸小細(xì)胞癌nm23的表達(dá)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組nm23陽性率33．33%，低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組( 66．67%)，TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期組nm23陽性率33．33%，低于分期為Ⅰ+Ⅱ期組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0．05)。顯示nm23表達(dá)下調(diào)使正常免疫細(xì)胞對機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能減低，使失去調(diào)節(jié)的癌細(xì)胞生長旺盛，具備了更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，同時(shí)nm23的同源基因awd激活了CTP蛋白，使直腸正常細(xì)胞癌變數(shù)量增多，廣泛癌變細(xì)胞無限制生長，侵犯周圍腸壁血管，肌纖維及淋巴結(jié)。nm23表達(dá)率越低，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越高，TNM分期越高。nm23在直腸小細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶( matrix metalloproteinases，MMPs)是一組鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，可以降解不同的細(xì)胞外基質(zhì)［5］。MMP-3是MMP-s的一員，是人體內(nèi)降解ECM的主要酶類，MMP-3通過參與降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，并激活與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)的其他MMP-s、N-cadherin等參與癌腫的發(fā)生、發(fā)展。于秀文等［6］發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中MMP-3的表達(dá)增加，MMP-3與結(jié)腸癌分化程度，浸潤深度無關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)MMP-3在直腸小細(xì)胞癌中高表達(dá)，浸潤至漿膜層的MMP-3表達(dá)率為62．16%，與未浸潤至

漿膜層的病例相比( 30．76%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜0．05) ;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例其陽性率為67．56%，與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比( 46．67%)，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0．05)。顯示MMP-3表達(dá)越高，越容易激活與直腸小細(xì)胞癌浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)的其他MMP-s、N-cadherin等，使癌細(xì)胞越容易侵及漿膜和淋巴道擴(kuò)散。MMP-3通過降解直腸小細(xì)胞癌細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，使癌細(xì)胞黏附力減低，使癌腫更容易生長，轉(zhuǎn)移。這些都提示MMP-3參與的直腸小細(xì)胞癌的發(fā)展，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，MMP-3可作為判斷直腸小細(xì)胞癌預(yù)后的指標(biāo)。

從Cox-2、nm23和MMP-3蛋白在直腸小細(xì)胞癌的表達(dá)，說明它們都參與了直腸小細(xì)胞癌的局部侵襲和遠(yuǎn)處播散，它們是否在直腸小細(xì)胞癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中起協(xié)同作用以及相互作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究?？傊畽z測Cox-2、nm23和MMP-3的表達(dá)可以判斷直腸小細(xì)胞癌患者的預(yù)后。

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·論著·

作者單位: 075000河北省張家口市，河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科(張劍虹、孫忠哲)，放療科(張飛) ;河北北方學(xué)院(張曉麗)

Expression and clinical significance of Cox-2，nm23 and MMP-3 in small cell carcinoma of rectum

ZHANG Jianhong*，ZHANG Fei，ZHANG Xiaoli，et al．*Department of Pathology，The First Hospital Affiliated to Hebei North University，Hebei，Zhangjiaku 075000，China

【Abstract】Objective To investigate the correlation between expression of Cox-2，nm23 and MMP-3 in small cell carcinoma of the rectum and clinicopathological characteristics．Methods The expression levels of Cox-2，nm23，MMP-3 in 63 cases of small cell carcinoma of rectum were detected by immunohistochemistry and tissue microarray technology．Results The positive expression rates of Cox-2，and MMP-3 were correlated to mesenteric lymph node metastasis and depth of tumor invasion，with the increase of infiltration depth of tumor，lymph node metastasis rate was increased ( P＜0．05)．The positive expression rates of Cox-2 and MMP-3 were not correlated to TNM staging ( P＞0．05)．However positive expression of nm23 protein was related with mesenteric lymph node metastasis and TNM staging ( P＜0．05)，with lymph node metastasis and increase of TNM stage，which was decreased ( P＜0．05)，however，which was not related to infiltration depth of tumor ( P＞0．05)．The expression levels of Cox-2，nm23，MMP-3 were not correlated to patient＇s age and sex ( P＞0．05)．Conclusion The expression levels of Nm23，Cox-2 and MMP-3 in small cell carcinoma of rectum are closely related to clinical prognosis，and combined detection can predict the malignant degree of tumor and can evaluate patient’s prognosis．

【Key words】cyclooxygenase; matrix metalloproteinases; tissue microarray technology; immunohistochemistry; samall cell carcinoma of the rectum

收稿日期:( 2014－07－11)

doi:10．3969/j．issn．1002－7386．2015．04．005

【中圖分類號】R 735．37

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002－7386( 2015) 04－0497－04