丁 艷，廖 旺，向 偉，楊慧蘭，何小解，黨西強(qiáng)，易著文

兒童狼瘡性腎炎患者中EB病毒潛伏膜蛋白1的表達(dá)

丁 艷1，2，廖 旺1，向 偉2，楊慧蘭3，何小解4，黨西強(qiáng)4，易著文4

摘要目的 通過(guò)實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、腎臟免疫組化和ELISA 3種方法研究?jī)和钳徯阅I炎（LN）中EB病毒（EBV）潛伏膜蛋白1（LMP-1）的表達(dá)，試圖探討LMP-1在兒童LN中的致病機(jī)制。方法 41例LN患兒和12例健康對(duì)照組，分別用RT-PCR法、免疫組化法、ELISA法檢測(cè)兩組外周血單核細(xì)胞（PBMCs）、腎臟組織及血清中LMP-1的表達(dá)。結(jié)果 ①RT-PCR法、免疫組化法、ELISA法檢測(cè)LN患兒和健康對(duì)照者的陽(yáng)性率分別為65.9%vs 8.3%，95.1% vs 16.7%，22.0%vs 8.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；②3種方法檢測(cè)LMP-1的表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)陽(yáng)性率高于其他兩種方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 兒童LN中存在EBV潛伏期基因LMP-1表達(dá)異常，其中腎臟組織中表達(dá)陽(yáng)性率最高，提示LMP-1可能參與了兒童LN的發(fā)病。

關(guān)鍵詞兒童；狼瘡性腎炎；潛伏膜蛋白1；EB病毒

2015-02-02接收

作者單位：1海南省人民醫(yī)院皮膚科，?？?570102

2海南省婦幼保健院皮膚科，?？?570206

3廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院皮膚科，廣州 510010

4中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心小兒腎臟專(zhuān)科，長(zhǎng)沙410011

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是累及全身多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，表現(xiàn)為T(mén)、B淋巴細(xì)胞異?；罨痛罅孔陨砜贵w產(chǎn)生［1］。兒童SLE通常臨床表現(xiàn)較嚴(yán)重，起病時(shí)急而重，是兒童時(shí)期預(yù)后較差的一種疾病。SLE患者幾乎100%腎活檢發(fā)現(xiàn)有腎臟受累，其中45%～85%有腎損害臨床表現(xiàn)，兒童狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）比成人更普遍、更嚴(yán)重［2-3］。近年來(lái)EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染與SLE發(fā)生發(fā)展的關(guān)系已成為SLE研究的熱點(diǎn)［4-5］。EBV具有嗜B淋巴細(xì)胞的特性，可終生潛伏于B淋巴細(xì)胞，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)造成持續(xù)和慢性刺激。EBV基因編碼的抗原和SLE患者的自身抗原有較高的同源性，有誘發(fā)自身免疫的可能［5］。該研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）、腎臟免疫組化和ELISA 3種方法研究?jī)和疞N中EBV潛伏期基因之潛伏膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP-1）的表達(dá)，試圖探討LMP-1在兒童LN中的致病機(jī)制。

1　材料與方法

1.1 病例資料 實(shí)驗(yàn)組來(lái)源于海南省婦幼保健院皮膚科與中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心小兒腎臟專(zhuān)科，選取了2009年1月～2013年11月收治的LN患兒41例，其中女30例，男11例；年齡6～16 （11.1±2.4）歲。SLE的診斷依據(jù)為1982年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修正的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，診斷為SLE基礎(chǔ)上行腎穿刺活檢確診為L(zhǎng)N。12例健康對(duì)照組腎臟組織及靜脈血均來(lái)自海南省婦幼保健院小兒外科急診創(chuàng)傷的患兒，患兒及患兒家族中無(wú)自身免疫性疾病史。其中女8例，男4例，年齡7～17（12.3±3.3）歲。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的年齡經(jīng)t檢驗(yàn)顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，性別構(gòu)成比比較采用χ2檢驗(yàn)，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究通過(guò)海南省婦幼保健院和中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，每個(gè)患兒家屬均簽署了知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法檢測(cè)LMP-1基因的表達(dá) 細(xì)胞分離及RNA提?。撼槿N患兒及健康對(duì)照組肝素抗凝靜脈血10 ml。用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離外周血單核細(xì)胞（PBMCs），用TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）提取RNA。cDNA合成采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Fermentans公司），反應(yīng)體系：1～5 μg RNA，5×Reaction Buffer 5 μl，2.5 U／μl Poly A Polymerase 1 μl，RT Mix 1 μl，總體積25 μl，37℃反應(yīng)1 h，85℃5 min。實(shí)時(shí)PCR：采用Icycler IQ實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-rad公司）檢測(cè)EBV基因LMP1的表達(dá)。引物序列由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，LMP1上游引物：5’-TTGGTGTACTCCTACTGATGATCACC-3’，下游引物：5’-AGTAGATCCAGATACCTAAGACAAGT-3’；PCR反應(yīng)體

積為20 μl，反應(yīng)體系為2×SYBR Green qPCR Mix 10 μl，（10 μmol／L）上下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，無(wú)酶水7 μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，之后每一步95℃變性10 s，引物58℃退火延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量法進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.2 免疫組化法檢測(cè)腎臟組織中LMP-1的表達(dá)

腎臟組織塊經(jīng)固定、石蠟包埋、脫蠟、水化及高溫高壓抗原修復(fù)等前期處理后，PBS緩沖液洗片3次，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育10～15 min。滴加一抗（此實(shí)驗(yàn)中一抗無(wú)需稀釋?zhuān)?00 μl，置于濕盒內(nèi)，4℃過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記羊抗鼠二抗工作液，室溫孵育10～15 min。滴加HRP標(biāo)記鏈霉親和素，室溫孵育10～15 min。PBS漂洗后DAB顯色，在顯微鏡下觀察染色程度；蘇木精復(fù)染（30 s～2 min），1%鹽酸酒精分化（1 s）；自來(lái)水沖洗10～15 min；烘干后中性樹(shù)膠封片，鏡檢。在均一條件下隨機(jī)選取切片的5個(gè)視野拍照（×200）。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)血清中LMP-1抗體的水平ELISA試劑盒購(gòu)于上海藍(lán)基公司，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。結(jié)果判定：置酶標(biāo)450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣本吸光度（optical density，OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出各樣本濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)陽(yáng)性率使用百分比表示，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或使用Fisher精確概率法。

2　結(jié)果

2.1 RT-PCR法檢測(cè)LMP-1基因的表達(dá) RTPCR法檢測(cè)41例LN患兒和12例健康對(duì)照者，發(fā)現(xiàn)27例（65.9%）患兒和1例（8.3%）健康對(duì)照者PBMCs中LMP-1基因表達(dá)呈陽(yáng)性，LN患兒的LMP-1基因表達(dá)的陽(yáng)性率與健康對(duì)照者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝10.12，P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 免疫組化法檢測(cè)LN患兒腎臟組織中LMP-1的表達(dá) 41例LN患兒和12例健康對(duì)照者腎臟組織中LMP-1蛋白表達(dá)結(jié)果如下：39例（95.1%）LN患兒和2例（16.7%）健康對(duì)照者表達(dá)呈陽(yáng)性，LN患兒腎臟的LMP-1表達(dá)的陽(yáng)性率與健康對(duì)照者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 ELISA法檢測(cè)血清中LMP-1蛋白水平 41 例LN患兒和12例健康對(duì)照者血清中LMP-1抗體的表達(dá)結(jié)果如下：9例（22.0%）LN患兒和1例（8.3%）健康對(duì)照者呈陽(yáng)性表達(dá)，LN患兒血清的LMP-1抗體表達(dá)的陽(yáng)性率與健康對(duì)照者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 3種方法檢測(cè)LN患兒LMP-1表達(dá)陽(yáng)性率的比較 3種方法檢測(cè)LN患兒EBV潛伏期基因LMP-1的表達(dá)，其檢出陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝26.971，P＝0.000）：免疫組化法和ELISA法的檢出陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝42.260，P＜0.001），免疫組化法和RT-PCR法的檢出陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝9.400，P＝0.002）。見(jiàn)表1。

表1　不同檢測(cè)方法檢測(cè)41例LN患兒LMP-1情況比較

3　討論

國(guó)內(nèi)外的大量研究［4-5］表明，SLE患者中EBV血清學(xué)陽(yáng)性率、病毒載量及EBV基因的表達(dá)都顯著高于健康對(duì)照者，提示EBV在SLE的發(fā)病中起著重要的作用。EBV在感染B淋巴細(xì)胞后，表達(dá)多種潛

伏蛋白，LMP-1是其中一種，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，是一種跨膜蛋白，通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)細(xì)胞異常生物學(xué)行為。LMP1提供替代B細(xì)胞的存活和分化的信號(hào)［5］。國(guó)外的研究［7-8］表明，LMP-1能夠通過(guò)多種機(jī)制加重SLE的自身反應(yīng)性，包括直接激活B細(xì)胞，增強(qiáng)B細(xì)胞活化的協(xié)同刺激信號(hào)，刺激B細(xì)胞活化因子（BAFF）的產(chǎn)生，能夠協(xié)助打破自我耐受等［9］。本研究通過(guò)RT-PCR、免疫組化法和ELISA法檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)兒童LN的LMP-1的表達(dá)顯著增加，提示LMP-1在兒童LN中可能起到重要的致病作用。

James et al［10］發(fā)現(xiàn)99%的SLE患者為EBV血清學(xué)陽(yáng)性，Yu et al［11］報(bào)道SLE患者外周血中有81.6%為EBV DNA陽(yáng)性，而健康對(duì)照者只有48.9%陽(yáng)性，本研究顯示使用ELISA法檢測(cè)LN患兒血清中LMP-1蛋白的表達(dá)，僅有22%的陽(yáng)性率，RTPCR法檢測(cè)LN患兒血液中LMP-1基因表達(dá)，僅有65.9%的陽(yáng)性率，均低于國(guó)外的研究?？紤]可能原因是：①?lài)?guó)外EBV血清學(xué)研究是針對(duì)EBV殼抗原（VCA）的抗體研究，存在敏感性高但特異性較低的問(wèn)題。②本實(shí)驗(yàn)是針對(duì)LMP-1 DNA的特異性檢測(cè)，故檢出率較國(guó)外EBV DNA檢測(cè)陽(yáng)性率低。

本實(shí)驗(yàn)41例LN患兒腎臟組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示95.1%的患兒有LMP-1的表達(dá)，較Yu et al［12］報(bào)道的陽(yáng)性率（58.6%）高，可能與本實(shí)驗(yàn)均為L(zhǎng)N兒童患者，兒童的EBV感染率較成人更高、更容易累及腎臟有關(guān)。

3種方法檢測(cè)LN患兒LMP-1的表達(dá)，腎臟組織免疫組化陽(yáng)性率最高，較其它兩種方法有顯著性差異，提示EBV感染表達(dá)的LMP-1可能與兒童LN的腎臟病變有重要關(guān)系，腎臟組織免疫組化可能成為診斷EBV相關(guān)性LN的重要手段，而ELISA法及RT-PCR法檢測(cè)血液中LMP-1的表達(dá)可能成為預(yù)示LN的診斷方法。

參考文獻(xiàn)

［1］ 丁 艷，肖 嶸，張 燕，等.SLE患者T淋巴細(xì)胞CD70基因表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)的研究［J］.中華皮膚科雜志，2013，46（2）：80-4.

［2］ Mina R，von Scheven E，Ardoin S P，et al.Consensus treatment plans for induction therapy of newly diagnosed proliferative lupus nephritis in juvenile systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Care Res（Hoboken），2012，64（3）：375-83.

［3］ Sato V A，Marques I D，Goldenstein P T，et al.Lupus nephritis is more severe in children and adolescents than in older adultsf［J］.Lupus，2012，21（9）：978-83.

［4］ Draborg A H，Duus K，Houen G.Epstein-Barr virus and systemic lupus erythematosus［J］.Clin Dev Immunol，2012，370516.

［5］ Larsen M，Sauce D，Deback C，et al.Exhausted cytotoxic control of Epstein-Barr virus in human lupus［J］.PLoS Pathog，2011，7 （10）：e1002328.

［6］ Tan E M，Cohen A S，F(xiàn)ries J F，et al.The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Rheum，1982，25（11）：1271-7.

［7］ Wrobel C M，Geiger T R，Nix R N，et al.High molecular weight complex analysis of Epstein-Barr virus Latent Membrane Protein 1 （LMP-1）：Structural insights into LMP-1′s homo-oligomerization and lipid raft association［J］.Virus Res，2013，178（2）：314-27.

［8］ Peters A L，Stunz L L，Meyerholz D K，et al.Latent Membrane Protein 1，the EBV-Encoded Oncogenic Mimic of CD40，Accelerates Autoimmunity in B6.Sle1 Mice［J］.J Immunol，2010，185 （7）：4053-62.

［9］ Yurasov S，Wardemann H，Hammersen J，et al.Defective B cell tolerance checkpoints in systemic lupus erythematosus［J］.J Exp Med 2005，201（5）：703-11.

［10］James J A，Neas B R，Moser K L，et al.Systemic lupus erythematosus in adults is associated with previous Epstein-Barr virus exposure［J］Arthritis Rheum，2001，44（5）：1122-6.

［11］Yu S F，Wu H C，Tsai W C，et al.Detecting Epstein-Barr virus DNA from peripheral blood mononuclear cells in adult patientswith systemic lupus erythematosus in Taiwan［J］.Med Microbiol Immunol，2005，194（3）：115-20.

［12］Yu X X，Yao C W，Tao J L，et al.The expression of renal Epstein-Barr virus markers in patients with lupus nephritis［J］.Exp Ther Med，2014，7（5）：1135-40.

The expression of LMP-1 gene in juvenile lupus nephritis

Ding Yan1，2，Liao Wang1，Xiang Wei2，et al
（1Dept of Dermatology，Hainan General Hospital，Haikou 570102，2Dept of Dermatology，Maternal and Child Health Care Hospital of Hainan Province，Haikou 570206）

AbstractObjective To discuss the role of latent membrane protein 1（LMP-1）in the pathgenesis of juvenile lupus nephritis（LN）through investigating expression of LMP-1 by RT-PCR，immunohistochemistry and ELISA.

Methods RT-PCR，immunohistochemistry and ELISA were applied to detect expression of LMP-1 in PBMCs，kid-

ney tissue and serum from 20 patients with LN and 12 healthy control subjects respectively.Results ①There was signifcant difference between juvenile LN patients and healthy controls by RT-PCR，immunohistochemistry and ELISA，Positive rate were 65.9%vs 8.3%，95.1%vs 16.7%，22.0%vs 8.3%，respectively（P＜0.05）.②Positive rates of LMP-1 in juvenile LN were significantly different among three methods and the positive rate detected by immunohistochemistry was higher than the other two methods（P＜0.05）.Conclusion The results demonstrate that there are aberrant expression of LMP-1 gene in juvenile LN，thepositive rate of LMP-1 in kidney tissue is highest，suggesting that LMP-1 gene may contribute to the pathgenesis of juvenile LN.

Key wordsjuvenile；lupus nephritis；latent membrane protein 1；Epstein-Barr virus

作者簡(jiǎn)介：丁 艷，女，博士研究生；何小解，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者：E-mail：hexj7150＠163.com；向 偉，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xiangwei8＠163.com

基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金（編號(hào)：814314、309079）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）05-0676-04

中圖分類(lèi)號(hào)R 373.9；R 758.69