文 / 李冰, 于長青*, 郝琴, 張曉雪, 魏文慧

(甘肅省輕工研究院 分離技術(shù)開發(fā)中心 天然產(chǎn)物工程技術(shù)研究中心, 甘肅 蘭州730000)

超聲波協(xié)同酶法提取紅芪多糖工藝優(yōu)化

文 / 李冰, 于長青*, 郝琴, 張曉雪, 魏文慧

(甘肅省輕工研究院 分離技術(shù)開發(fā)中心 天然產(chǎn)物工程技術(shù)研究中心, 甘肅 蘭州730000)

本研究以甘肅道地藥材紅芪為研究對象，以超聲波協(xié)同酶解技術(shù)為提取方法，利用單因素試驗和響應(yīng)面分析，優(yōu)化紅芪多糖的提取工藝。結(jié)果表明，紅芪多糖的最佳提取條件為：提取溫度為60.00 ℃，超聲功率為120.00 W，溶液pH值為5.0，料液比為1:10，用酶量為0.4%，紅芪多糖提取率為5.98%，為超聲波協(xié)同酶解技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用提供理論指導(dǎo)及依據(jù)。

超聲波; 纖維素酶; 紅芪多糖; 提取率

紅芪(Radix Hedysari)又叫巖黃芪、晉芪、獨根[1]，系多序巖黃芪(Hedysarum Poly-botrys Hand.-Mazz.)的干燥根，與黃芪同科異屬，為多年生草本[2]。其根多為粗狀、深長，外皮暗紅褐色的直系根[3]；主要分布于甘肅宕昌、武都、岷縣、舟曲、臨潭、漳縣、西和、禮縣、武山等地，生于海拔1800~2500米的高原山脊、臺地及溝谷邊[4,5]。紅芪性溫、味甘，具有補氣固表、利尿排毒、排膿、斂瘡生肌等功效[6]。紅芪富含多糖、黃酮、皂苷、氨基酸及微量元素等多種有效成分，其中紅芪多糖(HPS)因具有提高超氧化物歧化酶活性，增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗腫瘤等多種生物效應(yīng)，一直成為人們研究的熱點[7-10]。

目前，紅、黃芪多糖的提取方法多為傳統(tǒng)熱水浸提法[5]、超聲波輔助提取法[11]、微波輔助提取法[12]、酶法提取[5]等方法，研究也主要集中在對某種單一提取方法單因素或多因素的正交優(yōu)選方面，而對這些提取方法之間的協(xié)同作用的研究所見不多。本文以甘肅道地藥材紅芪為研究對象，以超聲波協(xié)同酶解技術(shù)為提取方法，利用單因素試驗和響應(yīng)面分析，優(yōu)化紅芪多糖的提取工藝，為超聲波協(xié)同酶解技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用提供理論指導(dǎo)及依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 材料與試劑

紅芪(購置于甘肅省隴南市宕昌縣)；纖維素酶(500000~1400000U/g,甘肅華羚生物科技有限公司)；檸檬酸(分析純，)；無水乙醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；葡萄糖(分析純，天津市北辰方正試劑廠)；苯酚(分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司)；濃硫酸(分析純，天津市百世化工有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

ACS-A型電子天平(上海友聲衡器有限公司)；CTXNW-10B超聲循環(huán)提取機(jī)(北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；RE5220型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海榮亞生化儀器廠)；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海榮亞生化儀器廠)；SHZ-CB型循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市予華一起有限責(zé)任公司)；DL-5M型低速冷凍離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；DZG-6050型真空干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)；AB104-N型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；W201S型恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)；722s型可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)。

1.3 實驗內(nèi)容和方法

1.3.1 紅芪多糖的提取

將清洗、干燥后的紅芪原料(水分含量≤13%)粉碎至45目，稱量后加入一定量的蒸餾水，用檸檬酸調(diào)節(jié)至一定pH值后，按酶量/紅芪粉末質(zhì)量百分比加入一定量的纖維素酶，投入超聲波提取裝置，在一定溫度、一定功率條件下間歇超聲(超聲時間:間歇時間為1:1)攪拌(80r/min)提取3次，每次30 min。合并提取液，90℃滅酶活，以4000 r/min離心15min，取上層清液，70℃濃縮。濃縮液加入等體積三氯乙酸-正丁醇(V:V=1:10)振蕩靜置分層，收下層水溶液，再以4000r/min離心15min，取上層清液加入無水乙醇至30%，靜置6h后以4000 r/min離心15min，取沉淀70℃真空干燥得到紅芪多糖。

1.3.2 紅芪多糖含量的測定

總多糖含量 (%)：苯酚-硫酸法[13]

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

以紅芪多糖提取率為衡量指標(biāo)，對提取溫度、超聲功率、料液比、溶液pH值、酶用量5個單因素進(jìn)行考察。

1.3.4 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計

在單因素的基礎(chǔ)上，采用的中心組合實驗設(shè)計原理[14]，以提取溫度(X1)、超聲功率(X2)、料液比(X3)、溶液pH值(X4)、酶用量(X5)為自變量，展開五因素三水平的響應(yīng)曲面試驗，建立最小二乘法擬合二次多項式數(shù)學(xué)模型，利用此模型確定超聲波協(xié)同酶法提取紅芪多糖工藝中的最佳提取條件及最大提取率。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

單因素試驗設(shè)計采用ANOVA進(jìn)行方差分析，利用Duncan法進(jìn)行多重比較；響應(yīng)曲面試驗設(shè)計采用F檢驗(tape III)對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)分析分別采用Spss19.0和Design Expert7.0軟件。

2、結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.2.1 提取溫度的影響

在料液比1:10，溶液pH值5.0，用酶量為0.6 %，超聲功率120 W條件下，分別探討30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的提取溫度對紅芪多糖提取率的影響。提取率與提取溫度的關(guān)系見圖1(a)。

由圖1(a)可知，隨著提取溫度的升高，紅芪多糖的提取率隨之顯著增加(P＜0.05)，當(dāng)提取溫度達(dá)到50℃時，提取率達(dá)到峰值，這是因為溫度的升高不僅會使萃取劑的傳質(zhì)系數(shù)增加， 度下降，從而引起多糖分子溶出的增加[15]；而且，酶活也逐漸達(dá)到最適溫度，促進(jìn)了酶對紅芪細(xì)胞壁的分解，使得多糖的提取率增加[13]。當(dāng)溫度超過50℃，紅芪多糖的提取率隨之顯著降低(P＜0.05)，這可能是因為溫度的升高使得酶活性的降低或酶部分失活，從而影響了紅芪的水解效果。

2.2.2 超聲功率的影響

在料液比1:10，溶液pH值5.0，用酶量為0.6%，提取溫度50℃條件下，分別探討80W、100W、120W、140W、160W的超聲功率對紅芪多糖提取率的影響。提取率與超聲功率的關(guān)系見圖1(b)。

由圖1(b)可知，紅芪多糖提取率隨超聲功率的升高而顯著增大(P＜0.05)，當(dāng)超聲功率超過120W，紅芪多糖提取率趨于平緩。這說明適當(dāng)?shù)纳叱暪β士梢栽鰪?qiáng)超聲波所產(chǎn)生的空穴力，提高多糖分子的運動使其溶出，并且可能會一定程度的增強(qiáng)酶的活力，從而促進(jìn)提取過程中對紅芪細(xì)胞壁的破壞作用。

2.2.3 溶液pH值的影響

在料液比1:10，用酶量為0.6%，提取溫度50℃，超聲功率120W條件下，分別探討2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的溶液pH值對紅芪多糖提取率的影響。提取率與溶液pH值的關(guān)系見圖1(c)。

由圖1(c)可知，紅芪多糖提取率隨著溶液pH值的升高而顯著增大(P＜0.05)，并在pH值為5.0時提取率達(dá)到峰值，說明適宜的pH值會提高酶和底物的相互結(jié)合，并發(fā)生催化作用，從而使酶解效果達(dá)到最佳。當(dāng)溶液pH值大于5.0時，紅芪多糖提取率隨著pH的增大而顯著降低(P＜0.05)，這可能由于已過最適宜pH值所導(dǎo)致的酶活性降低，從而引起提取率的下降。

2.2.4 料液比的影響

在溶液pH值5.0，用酶量為0.6%，提取溫度50℃，超聲功率120W條件下，分別探討1:6、1:8、1:10、1:12、1:14的料液比對紅芪多糖提取率的影響。提取率與料液比的關(guān)系見圖1(d)。

由圖1(d)可知，隨著溶液體積的增加，紅芪多糖的提取率隨之顯著增加(P＜0.05)，但料液比達(dá)到1:10之后多糖提取率趨于平緩。這主要是因為增加提取液的用量能夠使多糖分子充分的溶出，但多糖分子基本溶出后再增加提取液的用量也無法使多糖的提取率有顯著的提升。

2.2.5 用酶量的影響

在料液比1:10，溶液pH值5.0，提取溫度50℃，超聲功率120 W條件下，分別探討0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的用酶量對紅芪多糖提取率的影響。提取率與用酶量的關(guān)系見圖1(e)。

由圖1(e)可知，隨著用酶量的增加，紅芪多糖提取率呈增加的趨勢，在用酶量為0.3%時達(dá)到最大，之后隨著酶添加量的繼續(xù)增加，提取率開始逐漸減少。這主要是因為：(1)加酶量越大，內(nèi)容物釋放量越大，底物減少，使得一部分酶沒有足夠的底物結(jié)合，從而使多糖提取率下降。(2)酶濃度的增加，多糖中某些糖苷鍵會被過量的酶所分解，多糖提取率會隨之下降。

圖1 不同因素對紅芪多糖提取率的影響Fig.1 The influence of different factors on extraction yield of Radix Hedysari

2.2 響應(yīng)曲面試驗

2.2.1 模型方程的設(shè)計及結(jié)果

在單因素的試驗基礎(chǔ)上，采用Box—Behnken設(shè)計法，對超聲波協(xié)同纖維素酶法提取紅芪多糖工藝進(jìn)行3因素優(yōu)化試驗設(shè)計。響應(yīng)面因素與水平見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken試驗因素及水平

表2 Box—Behnken試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

表3 回歸分析結(jié)果

由表3可知，該實驗所選模型(P＜0.001)差異極其顯著，且失擬項(P＞0.05)差異不顯著；模型擬合度R2=0.9490，校正決定系數(shù)Radj2=0.9081，說明該模型與實際試驗擬合良好，可解釋90.81%的響應(yīng)值變化。擬合方程一次項X2、X3對紅芪多糖的提取率影響極其顯著(P＜0.01)；擬合方程二次項X22、X32、X42對紅芪多糖的提取率影響極其顯著(P＜0.01)；擬合方程X2X5對紅芪多糖的提取率影響極其顯著(P＜0.01)，X1X3對其提取率影響顯著(P＜0.05)。綜上，五因素對紅芪多糖提取率影響程度由大到小依次為：超聲功率＞溶液pH值＞料液比＞提取溫度＞用酶量，且超聲功率與用酶量、提取溫度與溶液pH值存在協(xié)同影響紅芪多糖提取率的作用。

2.2.2 工藝提取條件的優(yōu)化

根據(jù)Box-Bwhnken試驗所得結(jié)果，結(jié)合回歸模型，預(yù)測紅芪多糖提取率的最佳工藝條件為：在提取溫度為60.00℃，超聲功率為120.00W，溶液pH值為4.82，料液比為1:10.33，用酶量為0.4%時，提取率為6.06%。為簡化試驗操作，將其最佳提取條件修正為：提取溫度為60.00℃，超聲功率為120.00W，溶液pH值為5.0，料液比為1:10，用酶量為0.4%

2.2.3 優(yōu)化工藝的驗證試驗

按修正后最佳提取條件進(jìn)行驗證試驗，測得紅芪多糖提取率為5.98%，RSD=1.01（見表4）。實際測得紅芪多糖提取率與預(yù)測值6.06%之間無顯著差異(P=0.386)。

表4 最佳提取條件驗證試驗結(jié)果

3 、結(jié)論

本研究以甘肅道地藥材紅芪為研究對象，以超聲波協(xié)同酶解技術(shù)為提取方法，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design Expert軟件，運用Box-Behnken試驗設(shè)計，采用響應(yīng)曲面分析法，建立了紅芪多糖提取率與各因素間的擬合模型，對工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了最佳工藝條件：在提取溫度為60.00℃，超聲功率為120.00W，溶液pH值為5.0，料液比為1:10，用酶量為0.4%下，紅芪多糖提取率為5.98%，為超聲波協(xié)同酶解技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用提供理論指導(dǎo)及依據(jù)。

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