文 / 李得信，師希雄，文鵬程，張炎，汪月，張忠明，張衛(wèi)兵

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州，730070）

牦牛血粉酶法制備氯化血紅素工藝研究

文 / 李得信，師希雄，文鵬程，張炎，汪月，張忠明，張衛(wèi)兵

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州，730070）

為研究牦牛血資源的合理開(kāi)發(fā)利用，試驗(yàn)以牦牛血粉為原料，采用酶法制備氯化血紅素。研究了酶解溫度、pH、時(shí)間、酶添加量等因素對(duì)氯化血紅素制備的影響。試驗(yàn)表明，酶法制備氯化血紅素的最佳工藝參數(shù)為：酶解溫度55℃、酶解pH8.0、酶解時(shí)間5h、酶添加量為0.6%。此條件下氯化血紅素的得率達(dá)到15.203mg/g。

牦牛血粉；氯化血紅素；酶法

氯化血紅素是吸收率最高的生物態(tài)鐵劑，已經(jīng)成為比較理想的抗貧血藥，并且其藥理已被臨床證實(shí)。同時(shí)，氯化血紅素在醫(yī)藥行業(yè)中已被廣泛應(yīng)用于血卟啉及其衍生物的制備[1-3]。從動(dòng)物血液中制備得到的血紅素產(chǎn)品一般為氯化高鐵血紅素(即氯化血紅素Hemin)[4-5]。我國(guó)牦牛數(shù)量多，牦牛血資源豐富。牦牛血中的血紅蛋白含量高，從中提取制備氯化血紅素，原料獨(dú)特豐富，成本較低，能夠產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[6-8]。當(dāng)前，氯化血紅素的制備方法很多為有機(jī)溶劑提取，而這些方法多數(shù)存在毒性大、成本高、工藝煩瑣復(fù)雜、安全性低等缺點(diǎn)。用酶法制備氯化血紅素，利用酶對(duì)蛋白的水解能力，從而將氯化血紅素從中釋放出來(lái)，具有生產(chǎn)成本低和生產(chǎn)方法簡(jiǎn)單、環(huán)保的特點(diǎn)[9]。

本試驗(yàn)以牦牛血粉為原料，對(duì)氯化血紅素的粗提取工藝進(jìn)行初步探索與研究，旨在探索出一種以牦牛血粉為原料提取制備氯化血紅素的技術(shù)方法，從而為氯化血紅素的低成本企業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1、材料與試劑

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

牦牛血粉：蘭州天和生物催化技術(shù)有限公司提供；氯化血紅素標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；氫氧化鈉：分析純，成都市科龍化工試劑廠；鹽酸：分析純，白銀良友化學(xué)試劑有限公司；堿性蛋白酶：上海源葉生物科技有限公司

1.2試驗(yàn)儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；PHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；AL204電子分析天平梅特勒-托利多儀器有限公司；MR 3001磁力攪拌器 Heidolph；HWS26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司

2、試驗(yàn)方法

2.1氯化血紅素制備工藝流程

牦牛血粉 → 加酶 →調(diào)節(jié)pH→ 水解5小時(shí) →煮沸滅酶→調(diào)pH至3.5 → 離心→氯化血紅素

2.2不同酶解溫度對(duì)氯化血紅素得率的影響

加入2.0g血粉/100mL水，0.4%加酶量(即0.4%酶底比)，分別選取溫度為45、50、55、60、65℃，調(diào)節(jié)溶液pH7.5，5h水解，95℃煮沸滅酶15min后，調(diào)溶液pH到3.5，在4000r/min條件下離心15min，測(cè)定吸光度值并計(jì)算得率。

2.3.不同酶解pH對(duì)氯化血紅素得率的影響

加入2.0g血粉/100mL水，0.4%加酶量，酶解溫度55℃，分別選取pH6.5、7、7.5、8、8.5調(diào)節(jié)溶液，5h水解，95℃煮沸滅酶15min，調(diào)溶液pH到3.5，在4000r/min條件下離心15min，測(cè)定吸光度值并計(jì)算得率。

2.4不同酶解時(shí)間對(duì)氯化血紅素得率的影響

加入2.0g血粉/100mL水，0.4%加酶量，酶解溫度55℃，調(diào)節(jié)溶液pH7.5，分別選取2h、3h、4h、5h、6h進(jìn)行酶水解反應(yīng)，95℃煮沸滅酶15min，調(diào)溶液pH到3.5，在4000r/min條件下離心15min，測(cè)定吸光度值并計(jì)算得率。

2.5 不同酶添加量對(duì)氯化血紅素得率的影響

加入2.0g血粉/100mL水，分別選取0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的酶添加量，酶解溫度55℃，調(diào)節(jié)溶液pH7.5，5h進(jìn)行酶水解，95℃煮沸滅酶15min，調(diào)溶液pH到3.5，在4000r/min條件下離心15min，測(cè)定吸光度值并計(jì)算得率。

2.6正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，酶解溫度、酶解pH、酶解時(shí)間和酶液添加量4個(gè)因素各取3個(gè)水平，采用正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以進(jìn)一步優(yōu)化以牦牛血粉為原料酶法制備氯化血紅素的工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2.6樣品中氯化血紅素的測(cè)定

取經(jīng)過(guò)105℃干燥至恒重的氯化血紅素樣品，研成粉末；精密稱取適量樣品，置于100mL燒杯中，加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液溶解，將溶液轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液至刻度，搖勻，過(guò)濾。取濾液10mL于100ml容量瓶中，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，以0.1mol/L的氫氧化鈉溶液為空白，在390±1nm處測(cè)定樣品的吸光度。根據(jù)血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品中氯化血紅素的質(zhì)量，計(jì)算樣品中血紅素的純度和得率[10-13]。

3、結(jié)果與分析

3.1不同酶解溫度對(duì)氯化血紅素得率的影響

酶解溫度對(duì)氯化血紅素得率的影響如圖1所示。

圖1 酶解溫度對(duì)氯化血紅素得率的影響。

由圖1可以得出，溫度對(duì)酶水解的影響很大，氯化血紅素的得率總體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。在溫度為45℃-50℃范圍內(nèi)，氯化血紅素得率增幅較大，當(dāng)溫度升高到60℃時(shí)達(dá)到最高。當(dāng)處理溫度達(dá)到55℃時(shí)，氯化血紅素的得率達(dá)到14.937mg/g。當(dāng)處理溫度到60℃時(shí)，氯化血紅素得率升高不顯著，為15.101mg/g，溫度為65℃時(shí)，得率下降。由于生產(chǎn)中要節(jié)約成本，應(yīng)該選擇的酶解溫度為55℃。

3.2不同酶解pH對(duì)氯化血紅素得率的影響

不同酶解pH對(duì)氯化血紅素得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶解pH對(duì)氯化血紅素得率的影響。

由圖2可以得出，當(dāng)酶解pH在7-8的范圍內(nèi)，酶解效果較好，氯化血紅素得率都在13mg/g以上，其中當(dāng)pH為7.5時(shí)，氯化血紅素的得率最高，達(dá)到15.037mg/g。當(dāng)酶解pH高于8時(shí)，由于堿性蛋白酶的活性受到抑制，氯化血紅素未能完全釋放出來(lái)，得率明顯下降。因此取酶解pH為7-8較為適宜。

圖3 酶解時(shí)間及酶的添加量對(duì)氯化血紅得率的影響。

3.3不同酶水解時(shí)間對(duì)氯化血紅素得率的影響

由圖3可以得到，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，更多的血紅蛋白被分解為多肽和血紅素，使產(chǎn)物的純度升高，氯化血紅素的得率也逐漸增加，當(dāng)?shù)?h時(shí)，得率達(dá)到14.978mg/g，超過(guò)5h后，得率增加緩慢，只有0.1左右的增加幅度，由于生產(chǎn)中要盡量縮短生產(chǎn)周期，所以選用的酶解時(shí)間為5h。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，堿性蛋白酶會(huì)將更多的血紅蛋白分解成多肽溶解到溶液中，從而血紅蛋白的含量會(huì)減少，總質(zhì)量降低，純度降低。

3.4不同酶添加量對(duì)氯化血紅素得率的影響

酶添加量對(duì)氯化血紅素得率的影響如圖4所示。

圖4 酶的添加量對(duì)氯化血紅得率的影響。

由圖4可以得出，隨著酶添加量的增加，氯化血紅素得率呈逐漸上升趨勢(shì)，當(dāng)酶添加量為0.6%時(shí)，氯化血紅素的率達(dá)到最高14.773mg/g，超過(guò)0.6%時(shí)，酶量使底物逐漸飽和，抑制了反應(yīng)，降低了氯化血紅素的得率。

3.5正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析分別見(jiàn)表2和表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)方差分析表

由表2可以看出，四個(gè)因素對(duì)產(chǎn)量的影響作用由大到小依次為：酶解溫度＞酶解pH＞酶解時(shí)間＞酶添加量。得到提取制備氯化血紅素的最優(yōu)參數(shù)組合為A1B2C2D2，即酶解溫度55℃，酶解pH8.0，酶解時(shí)間5h，酶添加量為0.6%。由表3的方差分析結(jié)果可以看出，酶解溫度和酶解pH對(duì)氯化血紅素得率的影響非常顯著(P<0.01)，酶解時(shí)間對(duì)氯化血紅素得率的影響較顯著(P=0.013)，而酶的添加量對(duì)氯化血紅素得率的影響不顯著。

4、結(jié)論

結(jié)果表明，以牦牛血粉為原料酶法制備氯化血紅素的最佳工藝參數(shù)為酶解溫度55℃、酶解pH8.0、酶解時(shí)間5h、酶添加量為0.6%。在最優(yōu)組合的時(shí)，氯化血紅素的得率達(dá)到15.203mg/g。

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蘭州市科技局項(xiàng)目(2014-1-144) ；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)SRTP項(xiàng)目(20141030)