文 / 關(guān)曉艷，師希雄，文鵬程，汪月，張忠明，張衛(wèi)兵

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅蘭州，730070）

米黑毛霉產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵條件研究

文 / 關(guān)曉艷，師希雄，文鵬程，汪月，張忠明，張衛(wèi)兵

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅蘭州，730070）

為了進(jìn)一步提高米黑毛霉發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的活力，采用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響米黑毛霉產(chǎn)凝乳酶活力的起始pH、溫度、接種量及發(fā)酵時(shí)間等主要因素進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明: 溫度對(duì)米黑毛霉產(chǎn)凝乳酶活力影響最大，其次是接種量，發(fā)酵時(shí)間，起始pH 的影響較小。單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果確定的最佳發(fā)酵條件為: 在250mL三角瓶中裝發(fā)酵培養(yǎng)基（10g麩皮，10g營(yíng)養(yǎng)液），溫度為32℃，發(fā)酵時(shí)間為120h，接種量為4mL，起始pH為5，凝乳酶活力可達(dá)1682.37SU/mL。

米黑毛霉; 凝乳酶; 發(fā)酵條件

凝乳酶是奶酪生產(chǎn)過(guò)程中使牛奶凝固的關(guān)鍵性酶[1-3]。傳統(tǒng)干酪生產(chǎn)中應(yīng)用的凝乳酶是來(lái)自于小牛第四胃粘膜，但隨著世界乳酪產(chǎn)業(yè)不斷快速發(fā)展不斷壯大，單純靠宰殺犢牛來(lái)獲得凝乳酶不僅成本較高而且不能滿足乳制品行業(yè)快速發(fā)展的要求[3-6]。與傳統(tǒng)干酪生產(chǎn)中應(yīng)用的皺胃酶相比，微生物凝乳酶的生產(chǎn)時(shí)間短，產(chǎn)量高，受氣候、地域、時(shí)間等因素的影響較小，用微生物產(chǎn)凝乳酶可以降低其生產(chǎn)成本[7-9]，所以微生物凝乳酶成為凝乳酶研究的熱點(diǎn)[10-12]。

本試驗(yàn)以米黑毛霉作為研究對(duì)象，研究不同起始pH、溫度、接種量和發(fā)酵時(shí)間等對(duì)凝乳酶活力的影響，旨在篩選米黑毛霉產(chǎn)凝乳酶的最佳培養(yǎng)條件，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1、材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

米黑毛霉菌株HL-1: 甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2主要培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然。先將馬鈴薯去皮、洗凈、切成小塊，稱取200g加入1L蒸餾水，煮沸20min，用紗布過(guò)濾，濾液用蒸餾水補(bǔ)至1L，再加入20g瓊脂，121℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：將麩皮與營(yíng)養(yǎng)液按1:1(w/v)的比例混合，攪拌均勻，在121℃，0.15MPa下滅菌20min。營(yíng)養(yǎng)液用葡萄糖2.5%(w/w)，乳清粉2.0%(w/w)配制，硝酸銨1.0%(w/w)，pH自然。

1.1.3主要儀器

HH-SZ65型數(shù)顯恒溫水浴鍋，北京醫(yī)療設(shè)備廠；YZ-280型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司；HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；SW-CJ-ZFD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；PHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；MICRO17TR冷凍高速離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1菌株的活化

將米黑毛霉菌株接種于斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)4~5d，待長(zhǎng)滿黑色孢子后待用。

1.2.2孢子懸浮液的制備

向生長(zhǎng)良好的試管斜面種子中加入10mL的無(wú)菌生理鹽水，刮下孢子，移入裝有玻璃珠三角瓶中振蕩，在搖床上振蕩打散，再用帶脫脂棉的漏斗進(jìn)行過(guò)濾，并調(diào)整孢子數(shù)為106個(gè)/mL。

1.2.3粗酶液的制備

將1mL米黑毛霉種子液接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃的恒溫培養(yǎng)3d。培養(yǎng)完成后，加入100mL的蒸餾水，20℃、180r/min振蕩浸提1h，浸提液用四層紗布過(guò)濾，濾液于8000r/min離心15min，上清液即為粗酶液[13]。

1.2.4凝乳酶活力的測(cè)定

采用Arima法[14]。用0.01mol/L的CaCl2溶液溶配制10%的脫脂奶粉液，在室溫下放置40min后使用，取5mL10%的脫脂奶粉液在35°C下保溫10min，加入0.5mL在35°C保溫的粗酶液，迅速混合均勻，準(zhǔn)確記錄從加入酶液到乳凝固的時(shí)間(s)。在上述條件下，把40min凝固1mL100g/L脫脂乳的酶量定義為一個(gè)索氏單位（Soxhlet Unit）。

式中，t為凝乳時(shí)間，D為稀釋倍數(shù)。

1.2.5起始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

分別選取不同的初始pH值條件：4.5、5.0、5.5、6.0，以1mL的接種量接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，其他條件固定不變，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，28℃培養(yǎng)3d后收集菌體并處理后，測(cè)定凝乳酶活力。

1.2.6溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

分別設(shè)定發(fā)酵溫度為28℃、30℃、32℃、34℃、36℃，以1mL的接種量接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，其他條件固定不變，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)3d后收集菌體并處理后，測(cè)定凝乳酶活力。

1.2.7接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

以接種量分別為1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，其他條件固定不變，28℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)3d后收集菌體并處理后，測(cè)定凝乳酶活力。

1.2.8發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

分別設(shè)定發(fā)酵時(shí)間為84h、96h、108h、120h、132h，以1mL的接種量接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，其他條件固定不變，28℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，收集菌體并處理后，測(cè)定凝乳酶的活力。

1.2.9正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇起始pH、溫度、接種量和發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。

2、結(jié)果與分析

2.1起始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖1 起始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.1 The effect of initial pH on the MCA

初始pH會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響從而影響發(fā)酵產(chǎn)物中目標(biāo)酶的生成和累積[15]。由圖1可見(jiàn)，低酸性的培養(yǎng)環(huán)境更加有利于米黑毛霉的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)酶，但是pH過(guò)高或過(guò)低都會(huì)降低發(fā)酵產(chǎn)物中凝乳酶的產(chǎn)生和累積。當(dāng)起始pH為4.5~5.5時(shí)，凝乳酶活力隨pH升高而明顯升高，當(dāng)起始pH達(dá)到5.5時(shí)酶活力達(dá)最大值566.93 SU/mL，起始pH為5.5以上時(shí)，凝乳酶活力隨起始pH的升高有明顯下降。

2.2溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖2 溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.2 The effect of temperature on the MCA

溫度是微生物生長(zhǎng)的重要環(huán)境條件之一，在發(fā)酵過(guò)程中，選擇最適發(fā)酵溫度并不單單是選擇微生物生長(zhǎng)傳代速度最快的溫度，而是積累所需發(fā)酵代謝產(chǎn)物的最佳溫度[15]。由圖2可見(jiàn)，當(dāng)發(fā)酵溫度在28～30℃內(nèi)，凝乳酶的活力隨發(fā)酵溫度的升高迅速增長(zhǎng)；當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時(shí)，酶活力達(dá)到最大值1500.27SU/mL，溫度逐漸升高后，酶活力逐漸降低，隨溫度的升高，降低速率逐漸變慢。

2.3接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖3 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.3 The effect of inoculums size on the MCA

接種量直接關(guān)系到各時(shí)間段單位體積培養(yǎng)基中微生物數(shù)量的多少，接種量過(guò)小則發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，接種量過(guò)大則導(dǎo)致培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)供給影響產(chǎn)酶[15]。由圖3可見(jiàn)，接種量過(guò)低將延長(zhǎng)菌體的延滯期，導(dǎo)致菌體的生長(zhǎng)減慢，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，當(dāng)在發(fā)酵培養(yǎng)基（10g麩皮，10g營(yíng)養(yǎng)液）內(nèi)接種量為1~6mL內(nèi)，凝乳酶的活力隨接種量的增大逐漸增大，增大速率由慢變快，當(dāng)接種量達(dá)到6mL時(shí)，酶活力達(dá)到最大值1437.16SU/mL，當(dāng)接種量大于6mL時(shí)，酶活力逐漸降低，但隨接種量的升高，降低速率逐漸變慢，分析原因是此時(shí)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)已經(jīng)不能滿足微生物的生長(zhǎng)需求，微生物之間開(kāi)始競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，影響發(fā)酵產(chǎn)酶，當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)越厲害，產(chǎn)酶量越少酶活越低。

2.4發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 The effect of fermentation time on the MCA

在不同的生長(zhǎng)階段，微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求以及進(jìn)行次級(jí)代謝的途徑都會(huì)有所不同[15]。由圖4可見(jiàn)，在發(fā)酵前期（108h以前）隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物中凝乳酶的活性明顯呈上升趨勢(shì)，在發(fā)酵后期（120h以后）隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物中凝乳酶的活性反而開(kāi)始下降，分析的原因是培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分已經(jīng)不足以滿足生長(zhǎng)需要，生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在84～120h內(nèi)，凝乳酶的活力隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)迅速增長(zhǎng)，但增加速率逐漸變慢；當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到108～120h時(shí)，凝乳酶活力達(dá)到較大值，120h酶活力達(dá)到1555.66SU/mL，120h后，酶活力逐漸降低。

2.5正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)四因素三水平正交試驗(yàn)考察起始pH、溫度、接種量及發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶量的綜合影響。正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果分見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result analyses of orthogonal experiment

對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果表明四個(gè)因素對(duì)凝乳酶活力的影響為溫度＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間＞起始pH。在試驗(yàn)因子水平范圍內(nèi)，產(chǎn)酶量最高的組合是A1B3C1D3，即起始pH為5，溫度為32℃，接種量為4mL，發(fā)酵時(shí)間為120h。

為檢驗(yàn)正交試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，將產(chǎn)酶量最高的組合A1B3C1D3進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得的平均酶活為1693.52SU/mL，驗(yàn)證試驗(yàn)的酶活與正交試驗(yàn)中的最優(yōu)組合A1B3C1D3對(duì)應(yīng)的酶活（1682.37SU/mL）相對(duì)誤差為0.7%，說(shuō)明試驗(yàn)的結(jié)果是可靠的。

4、結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)，初步確定了有利于米黑毛霉產(chǎn)凝乳酶的起始pH、溫度、接種量和發(fā)酵時(shí)間的最優(yōu)值及最優(yōu)范圍。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)一步優(yōu)化，通過(guò)正交試驗(yàn)可以看出，4個(gè)因子對(duì)產(chǎn)酶的影響作用由大到小依次為溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間、起始pH。最終確定的最佳培養(yǎng)條件為：溫度為32℃，接種量為4mL，發(fā)酵時(shí)間為120h，起始pH為5。

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甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)專項(xiàng)(GNCX-2014-31)；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)SRTP項(xiàng)目(20141031)