李永波，吳　波,2，幕澤逕,2，趙紀(jì)峰，劉　翔，周華蓉，鐘國(guó)躍,2*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心，江西南昌330004；2.江西民族傳統(tǒng)藥現(xiàn)代科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，江西南昌330004；3.重慶市中藥研究院，重慶410065)

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5種藏醫(yī)藥用翠雀屬植物的ITS2分子鑒別研究

李永波1，吳波1,2，幕澤逕1,2，趙紀(jì)峰3，劉翔3，周華蓉3，鐘國(guó)躍1,2*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心，江西南昌330004；2.江西民族傳統(tǒng)藥現(xiàn)代科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，江西南昌330004；3.重慶市中藥研究院，重慶410065)

摘要:采用ITS2序列進(jìn)行翠雀屬5種藏醫(yī)藥用植物的分子鑒定。通過測(cè)定藍(lán)翠雀花(Delphiniumcaeruleum)、光序翠雀花(Delphinium.kamaonense)、翠雀花(Delphinium.grandiflorum)和三果大通翠雀花(D.kamanensevar.glabrescens)的ITS2序列，借助MEGA6.0軟件比較和分析ITS2序列特征，顯示翠雀屬5種藥用植物ITS2長(zhǎng)度均為220 bp，變異位點(diǎn)12個(gè)，其中信息位點(diǎn)9個(gè)；光序翠雀花與翠雀花遺傳距離最小，三果大通翠雀花與其余4種翠雀屬植物遺傳距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)果表明5種翠雀屬藥用植物的ITS2序列可作為分子鑒定的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：藏藥；翠雀屬；ITS2序列；分子鑒定

An ITS2 Sequence Analysis of Five Tibetan

翠雀屬(DelphiniumL.)是毛茛科(Ranunculaceae)中的一個(gè)大屬，全世界約300種，我國(guó)有113種，全國(guó)各地均有分布，以云南北部、西藏東部和四川西部等的高原地區(qū)分布的種類最為豐富，約有48種，17變種，1亞種[1]。該屬不少種類為藏藥特色藥材，以全草或花入藥，具有清熱解毒、疏肝利膽、止痛止瀉等功效，在臨床和民間常用于肝膽疾病、腸熱腹瀉、腸炎、痢疾、跌打損傷、風(fēng)濕、牙痛等癥，一些種類還可作為土農(nóng)藥，用來(lái)殺虱和蚊蠅的幼蟲[2]。由于目前藏藥材專業(yè)市場(chǎng)尚不健全，藏區(qū)各藏醫(yī)醫(yī)療機(jī)構(gòu)、制藥企業(yè)使用的藏藥材多為自行組織人員或委托各地牧民采集，同時(shí)各地用藥習(xí)慣也有差異，各地使用的來(lái)源于該屬植物的藏藥材的基原植物極為復(fù)雜。據(jù)對(duì)有關(guān)藏藥材的標(biāo)準(zhǔn)和專著文獻(xiàn)記載的統(tǒng)計(jì)分析[3]，藏醫(yī)藥用的翠雀屬植物約有28種(為藏醫(yī)藥用毛茛科植物中藥用種類最多的屬)，常見的種類有藍(lán)翠雀花(Delphinium.caeruleumJacq.exCamb.)、粗距翠雀花(Delphinium.pachycentrumHemsl.)、三果大通翠雀花(Delphinium.pylzowiivar.trigynumW.T.Wang)、光序翠雀花(Delphinium.kamaonenseHunth.)及其變種展毛翠雀(Delphiniumkamanensevar.glabrescensW.T.Wang)、翠雀花(Delphinium.grandiflorumL.)等，這些種類涉及到“夏剛巴”、“玄果貝”、“逮木薩”[4-5]等8個(gè)藥材品種，其“藥材-基原”也多有交叉，為保證臨床用藥準(zhǔn)確，有必要建立其有效的基原植物種鑒別方法。

準(zhǔn)確鑒定藥材的基原是保障臨床用藥準(zhǔn)確和安全有效的前提。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)為中藥材物種鑒定研究提供了方便快捷的方法，已被廣泛應(yīng)用于藥用植物的鑒別研究[6-9]，即通過采用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的DNA片段作為標(biāo)記，對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地識(shí)別和鑒定。相對(duì)其他分子標(biāo)記技術(shù)，DNA條形碼技術(shù)具有它們無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)：①鑒定過程更加快速，可以在短時(shí)間內(nèi)鑒定大量樣本；②試驗(yàn)過程標(biāo)準(zhǔn)化，操作簡(jiǎn)單，更容易實(shí)現(xiàn)物種鑒定的自動(dòng)化；③試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性和穩(wěn)定性高；④只需選用一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)合適的基因片段即可對(duì)整個(gè)屬、科甚至幾十個(gè)科的絕大部分物種進(jìn)行準(zhǔn)確地鑒定。ITS2序列作為藥用植物鑒別的標(biāo)準(zhǔn)條形碼序列[10]，在種間及種下居群間具有進(jìn)化速率快，變異程度高、區(qū)分物種能力強(qiáng)等特點(diǎn)，適用于藥用植物與其近緣種類等較低分類階元的分子鑒定[11-13]。近年來(lái)，有關(guān)藏藥品種的生藥鑒定有較多研究，而有關(guān)用ITS2序列鑒定翠雀屬藥用植物的研究未見報(bào)道。本研究以翠雀屬5種藥用植物為對(duì)象獲得ITS2序列，采用DNA條形碼技術(shù)從分子系統(tǒng)學(xué)角度探討它們的親緣關(guān)系，同時(shí)為藏醫(yī)藥用翠雀屬植物的基原鑒定提供分子依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)采集藍(lán)翠雀花、三果大通翠雀花、光序翠雀花、翠雀花共4個(gè)物種9個(gè)樣本，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鐘國(guó)躍研究員鑒定，憑證樣本保存于江西中醫(yī)藥大學(xué)植物標(biāo)本館。其余序列均來(lái)源于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，材料來(lái)源和GenBank數(shù)據(jù)詳見表1。

1.2方法

1.2.1DNA提取將實(shí)驗(yàn)樣品用75%乙醇擦拭表面后，用液氮研磨粉碎，取藥材50 mg，再加入1 mL核分離液(1 mol/L Tris-HCl pH8.0，0.5 mol/L EDTA pH8.0，0.7 mol/L NaCl，2%β-巰基乙醇，2%PVP-40)，渦旋5 min，棄上清。用核分離液分別處理3次后加入預(yù)熱的GP1再56 ℃水浴過夜。以預(yù)冷的異丙醇代替GP2沉淀DNA。其他步驟均參照DNA提取試劑盒(TIANGEN BIOTECH BEIJING CO.，LTD)的方法提取樣品總DNA。

1.2.2PCR擴(kuò)增及測(cè)序使用通用引物ITS2F(5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′)，ITS3R(5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為30 μL：ddH2O 10.8 μL，2×Taq MasterMix 15 μL，上下游引物各0.6 μL(10 μmol/L)，總DNA3 μL(10 mg/L)。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，再進(jìn)行35個(gè)循環(huán)：94 ℃、30 s，59 ℃、45 s，72 ℃、45 s；最后72 ℃延伸10 min。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。委托上海生工生物工程股份有限公司對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并進(jìn)行雙向測(cè)序，實(shí)驗(yàn)樣本序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)詳見表1。

表1　研究材料信息

1.2.3數(shù)據(jù)分析采用CodonCodeAlignerV 5.1(CodonCode Co.，USA)對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量區(qū)及引物區(qū)，并將所有實(shí)驗(yàn)樣本序列包括從GenBank下載的序列基于隱馬爾科夫模型的HMMer注釋方法去除兩端的5.8 s和28 s區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列[14]。然后，使用MEGA 6.0軟件對(duì)獲得的所有序列進(jìn)行同源性分析，并計(jì)算遺傳距離，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Bootstrap(1 000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率。

2結(jié)果與分析

2.15種翠雀屬植物的ITS2序列比較

測(cè)序結(jié)果表明，序列中除ITS2序列全長(zhǎng)外，還包含5.8 s和28 s的部分序列，翠雀屬4種藥用植物的ITS2序列已提交至NCBI，GenBank登錄號(hào)和對(duì)應(yīng)的植物名稱見表1。

利用MEGA 6.0對(duì)翠雀屬的16條ITS2序列進(jìn)行比對(duì)結(jié)果表明，光序翠雀花與翠雀花之間的差異最小，僅存在2個(gè)堿基的差別；粗距翠雀花與光序翠雀花有6個(gè)堿基的差異，與翠雀花有4個(gè)堿基的差異；藍(lán)翠雀花與光序翠雀花有5個(gè)堿基的差異，與翠雀花有3個(gè)堿基的差異；三果大通翠雀花與其余四種翠雀屬植物種間差異很大。翠雀屬5種藥用植物ITS2長(zhǎng)度均為220 bp，GC含量為71.8%～73.2%，共有12個(gè)變異位點(diǎn)，其中特異性位點(diǎn)9個(gè)，分別為44、46、62、79、85、142、159、173及202位點(diǎn)，分別占總位點(diǎn)數(shù)的5.45%和4.09%，具體變異位點(diǎn)信息詳見表2。

2.2聚類分析

基于Kimura 2-parameter計(jì)算5種藥用植物之間的遺傳距離，結(jié)果翠雀花與光序翠雀花親緣關(guān)系最近，種間平均K2P遺傳距離為0.007 0。光序翠雀花與三果大通翠雀花親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，種間平均K2P遺傳距離為0.038 0。

本研究基于ITS2序列，采用NJ法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)1 000次自舉檢測(cè)，從系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)可以看出，親緣關(guān)系較近光序翠雀花與翠雀花處于同一分支，并得到88%支持，之后以64%的支持率與粗距翠雀花聚為一起，與它們遺傳距離較遠(yuǎn)三果大通翠雀花自成另一分支。

表2　翠雀屬藥用植物ITS2序列變異位點(diǎn)

Bootstrap 1 000次重復(fù)，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%:1～4：藍(lán)翠雀花，GB登錄號(hào)分別為KT350987、KT350988、KT350989、KU095854；5～8：粗距翠雀花，GB登錄號(hào)分別為KF233841、KF022341、KF022339、KF022340；9～10：三果大通翠雀花，GB登錄號(hào)分別為KT350990、KT350991；11～12：光序翠雀花，GB登錄號(hào)分別為KT350992、JF976235；13～16：翠雀花，GB登錄號(hào)分別為KT350993、KT350994、KF022337、KF022338。圖2　基于ITS2序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2　NJ systematic tree based on ITS2 sequences

3討論

(1)本實(shí)驗(yàn)采用改良的DNA提取試劑盒法，通過提取前用核分離液處理以及延長(zhǎng)水浴時(shí)間等方法，可有效去除藥材色素、蛋白質(zhì)以及多酚類物質(zhì)，盡管提取出來(lái)的DNA降解相對(duì)嚴(yán)重，但并未影響后續(xù)的PCR擴(kuò)增及測(cè)序，這與羅焜[15]、辛天怡[16]等在中藥秦艽、羌活的研究報(bào)道一致。

(2)《中國(guó)植物志》把光序翠雀花、翠雀花、藍(lán)翠雀花劃分為翠雀屬翠雀組，三果大通翠雀花劃分為翠雀屬密花翠雀花組，粗距翠雀花劃分為翠雀屬滇川翠雀花組，由圖2可以看出這5個(gè)物種基本按照上述植物分類組的劃分聚為一起，但粗距翠雀花與光序翠雀花、翠雀花、藍(lán)翠雀花同聚在第一大分支中，這與傳統(tǒng)分類學(xué)觀點(diǎn)有少許分歧。由于本實(shí)驗(yàn)所選擇的種以及居群在翠雀屬和藏區(qū)內(nèi)所占的比例相對(duì)較小，故本文中基于ITS2序列分析的結(jié)果只能反映翠雀屬植物遺傳背景的一方面，尚難以準(zhǔn)確判斷，有關(guān)藏藥翠雀屬藥用植物分子系統(tǒng)學(xué)的深入研究還需要增加翠雀屬不同種、不同居群以及參考其他一些序列如psbA-trnH等做出進(jìn)一步的判斷。

(3)翠雀屬是藏醫(yī)藥用毛茛科植物種類中應(yīng)用最多的一個(gè)屬，涉及到多個(gè)藥材品種，各自在功能主治上也存在差異，《部頒標(biāo)準(zhǔn)·藏藥分冊(cè)》在“夏剛巴/展毛翠雀”條下收載的基原為“展毛翠雀(D.kamaonensevar.glabrescens)及同屬數(shù)種植物”，《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》以“玄果貝/囊距翠雀”收載了囊距翠雀(D.brunonianumRoyle.)，《青海省藏藥標(biāo)準(zhǔn)》(1992)也收載了“展毛翠雀(D.kamaonensevar.glabrescens)、翠雀(D.grandiflorum)、白藍(lán)翠雀花(D.albocoeruleumMaxim.)、大通翠雀(D.pylzowiiMaxim.)、藍(lán)翠雀(D.caeruleum)等多種”，反映出藏醫(yī)常用翠雀屬植物的種類和基原較為復(fù)雜，但上述標(biāo)準(zhǔn)中均僅有性狀或粉末鑒別，并且翠雀屬植物在形態(tài)上十分相似，藥材也較難區(qū)別，這種狀況顯然不利于保障其臨床用藥的準(zhǔn)確和安全有效。本研究結(jié)果顯示，從基于ITS2序列構(gòu)建的NJ樹可以看出，ITS2序列能夠很好的區(qū)分這5種藏醫(yī)常用翠雀屬植物，為其植物之間的鑒定提供了一定的分子標(biāo)記。

(4)本研究以5種藏醫(yī)常用翠雀屬植物為研究對(duì)象，利用DNA條形碼技術(shù)測(cè)定了其中4種藥用植物的ITS2序列，已提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，這在一定程度上豐富了NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中翠雀屬植物的序列信息。

參考文獻(xiàn)：

[1]吳玉虎.青藏高原維管植物及其生態(tài)地理分布[M].北京：科學(xué)出版社，2008：

[2]鞏紅冬.青藏高原東緣翠雀屬藏藥植物資原調(diào)查[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(6):3222.

[3]李敏，雷志強(qiáng)，鐘國(guó)躍.藏醫(yī)學(xué)藥用毛茛科植物藥材品種與標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)狀分析[J].中藥新藥與臨床藥理,2015(1):133-137.

[4]《中華本草》編委會(huì).中華本草·藏藥卷[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002.

[5]楊永昌.藏藥志[M].西寧：青海人民出版社，1991.

[6]Kress W J，Wurdack K J，Zimmer E A，et al．Use of DNA barcodes to identify flowering plants[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(23):8369-8374．

[7]Song J Y，Yao H，Li Y，et al.Authentication of the family Polygonaceae in Chinese pharmacopoeia by DNA barcoding technique[J]．J Ethnopharmacol，2009，124(3):434-439．

[8]Gao T，Yao H，Song J Y，et al． Identification of medicinal plantsin the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2[J]．J Ethnopharmacol，2010，130(1):116-121．

[9]陳士林，宋經(jīng)元，姚輝，等.藥用植物DNA條形碼鑒定策略及關(guān)鍵技術(shù)分析[J].中國(guó)天然藥物，2009(5):322-327.

[10]劉依麗，馮尚國(guó)，何仁鋒，等.基于ITS2條形碼對(duì)鐵皮石斛及其混偽品分子鑒定的初步研究[J].杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2014(1):35-41.

[11]羅焜，陳士林，陳科力，等．基于蕓香科的植物通用 DNA 條形碼研究[J]．中國(guó)科學(xué):生命科學(xué)，2010，30(4):342-351．

[12]朱英杰，陳士林，宋經(jīng)元，等．重樓屬藥用植物DNA 條形碼鑒定研究[J]．藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45(3):376-382．

[13]Pang X H，Song J Y，Chen S L，et al.Applying plant DNA bar codes for Rosaceae species identification[J].Cladistics，2011，27:165-170．

[14]KeHer A，Schleicher T，Schuhz J，et al．5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation[J].Gene，2009，430：50-57．

[15]羅焜,馬培,姚輝,等.多基原藥材秦艽ITS2 條形碼鑒定研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2012,47(12):1710-1717.

[16]辛天怡,姚輝,羅焜,等.羌活藥材ITS/ITS2 條形碼鑒定及其穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2012,47(8):1098-1105.

Medicine Plants ofDelphiniumL.

LI Yong-bo1，WU Bo1,2，MU Ze-jing1,2，ZHAO Ji-feng3，

LIU Xiang3，ZHOU Hua-rong3，ZHONG Guo-yue1,2*

(1.Research Center of Natural Resources of Chinese Medicinal Material and EthnicMedicine,Jiangxi University of Chinese Medicine,Nanchang 330004,China;2.Collaboration Innovation Center for the Modern Technology and Industial Development of Jiangxi Minority Traditional Medicine,Nanchang 330004,China;3.Chongqing Academy of Chinese Materia Medica,Chongqing 400065,China)

Abstact:The molecular identification of five Tibetan medicine plants inDelphiniumL.,Sequencingof ITS2 genes fromD.caeruleum,D.kamaonense,D.grandiflorumandD.kamanensevar.glabrescenswere performed.The sequence features were compared and analyzed using MEGA6.0 softwares.In the five Tibetan medicine plants inDelphiniumL.,the length of ITS2 was 220bp,with 12 variable sites and 9 parsimony information sites.The smallest genetic distance was observed betweenD.kamaonenseandD.grandiflorum,and the largest existed betweenD.kamanensevar.glabrescensand,the rest ofDelphiniumL.showed their farest genetic relationship.The conclusion is that ITS2 sequences of the five medicinal plants inDelphiniumL.can be used as the reference for molecular identification.

Key words:Tibetan medicine；DelphiniumL.；ITS2 sequence；molecular identification

作者簡(jiǎn)介：李永波(1989—)，男，碩士生，E-mail:lyb6638@sina.com；*通信作者：鐘國(guó)躍，研究員，博導(dǎo)，E-mail:zgy1037@163.com。

基金項(xiàng)目：“江西民族傳統(tǒng)藥現(xiàn)代科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心”資助項(xiàng)目(51316935)

收稿日期：2015-10-10修回日期：2015-10-25

中圖分類號(hào)：Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-2286(2015)06-1100-05

李永波，吳波，幕澤逕，等.5種藏醫(yī)藥用翠雀屬植物的ITS2分子鑒別研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，37(6)：1100-1104.