梁振綱，徐志偉，陳藝瑋，鄧世明，徐　莉

(1.海南大學(xué)海洋學(xué)院,海南?？?70228；2.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，海南?？?70311)

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高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中3種微囊藻毒素含量

梁振綱1,2，徐志偉2，陳藝瑋2，鄧世明1*，徐莉2

(1.海南大學(xué)海洋學(xué)院,海南海口570228；2.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，海南?？?70311)

摘要：建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中 microcystin-LR、microcystin-RR、microcystin-YR 3種微囊藻毒素含量的方法，對(duì)方法的提取、凈化條件和微囊藻毒素可能的質(zhì)譜裂解機(jī)理進(jìn)行研究。采用甲醇提取，HLB固相萃取柱凈化，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法定量，測(cè)定低限為5 μg/kg，以魚(yú)、蝦、牡蠣為陰性樣品，添加水平為0.005 mg/kg、0.010 mg/kg、0.020 mg/kg時(shí)，回收率范圍為85.2%～94.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.7%～8.1%。經(jīng)驗(yàn)證，此方法靈敏度、特異性和選擇性均能滿(mǎn)足水產(chǎn)品中微囊藻毒素的檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞：微囊藻毒素；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；水產(chǎn)品

近年來(lái)，隨著富營(yíng)養(yǎng)化程度的加劇，藍(lán)藻釋放的毒素已經(jīng)成為一類(lèi)廣泛存在的天然有毒物。其中微囊藻毒素(microcystins)是一類(lèi)單環(huán)七肽結(jié)構(gòu)的天然毒素，它分布廣，毒性強(qiáng)，可致家畜死亡和人類(lèi)中毒[1]。由于它能抑制蛋白質(zhì)磷酸酯酶，從而幫助解除對(duì)細(xì)胞增殖的正常制動(dòng)作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)育，是肝癌的強(qiáng)烈促癌劑。目前世界上已發(fā)現(xiàn)50多種微囊藻毒素，其中microcystin-LR、microcystin-RR和microcystin-YR毒性較大，含量也相對(duì)較多[2]，因此建立這3種微囊藻毒素的檢測(cè)方法非常重要。

由于微囊藻毒素類(lèi)化合物分子量較大，極性強(qiáng)，在樣品中含量低，有一定的檢測(cè)難度。目前文獻(xiàn)報(bào)道多采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器[3-4]和酶聯(lián)免疫法[5-6]等方法檢測(cè)水或藻類(lèi)中微囊藻毒素，由于水產(chǎn)品富含蛋白質(zhì)和脂肪類(lèi)物質(zhì)，基質(zhì)干擾大，因此鮮少文獻(xiàn)報(bào)道水產(chǎn)品基質(zhì)中微囊藻毒素的檢測(cè)。HPLC-紫外檢測(cè)器雖可對(duì)多肽進(jìn)行有效分離，但是在靈敏度和選擇性方面存在一定問(wèn)題；酶聯(lián)免疫法則存在難于定性、定量不準(zhǔn)等問(wèn)題。而電噴霧(ESI)質(zhì)譜作為一種可同時(shí)定性定量的技術(shù)，非常適合微囊藻毒素類(lèi)大分子物質(zhì)的檢測(cè)，且靈敏度和選擇性好，因此本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了水產(chǎn)品中微囊藻毒素的檢測(cè)方法，方法快速簡(jiǎn)便，定量準(zhǔn)確，并可在線(xiàn)定性，具有較強(qiáng)的適用性[7-8]。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

Agilent 1200超高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，API 4000Q四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)ABI公司)，配有電噴霧離子源；Harvard Ⅱ針泵(美國(guó)Varian公司)；MS3 Basic旋渦混勻器(廣州IKA公司)；Centrifuge 5810R離心機(jī)(Eppendorf公司)；G-285電子天平(Mettler公司)，氮吹儀(美國(guó)Caliper公司)。

乙腈、甲醇、甲酸為色譜純?cè)噭?美國(guó)TEDIA公司)，HLB固相萃取小柱(3 mL，60 mg，美國(guó)Waters公司)，微孔濾膜(0.22 μm，有機(jī)系)，微囊藻毒素-LR、微囊藻毒素-RR、微囊藻毒素-YR標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于等于95%，購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司)。標(biāo)準(zhǔn)溶液：用甲醇配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃避光保存。

地理國(guó)情普查是基于遙感影像采用計(jì)算機(jī)自動(dòng)解譯或人工解譯方法定量化獲取地表自然及人文地理要素的國(guó)情國(guó)力調(diào)查，解譯內(nèi)容涉及房屋、水體、道路、構(gòu)筑物、植被、裸露地表等多種要素。因此，解譯中遙感影像的信息使用量對(duì)地理國(guó)情普查至關(guān)重要。

近年來(lái)，陽(yáng)江航標(biāo)管理站的燈浮標(biāo)受熱帶氣候影響時(shí)有發(fā)生，當(dāng)燈浮標(biāo)附近風(fēng)力達(dá)11級(jí)左右時(shí)，燈浮標(biāo)就存在著移位的情況。如2014年“威馬遜”臺(tái)風(fēng)7月18日在海南文昌登陸，陽(yáng)西電廠附近當(dāng)時(shí)風(fēng)力12級(jí)左右，有部分燈浮標(biāo)移位或直接吹上岸邊；漭洲障礙物標(biāo)移位1000多m。

1.2樣品的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g粉碎均勻的樣品(精確至0.01 g)，置于50 mL具塞聚丙烯離心管中，加入10 mL甲醇，3 000 r/min渦旋混勻2 min，4 ℃下以8 500 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至玻璃試管中，40 ℃下氮?dú)獯抵良s1 mL，加水9 mL，混勻，轉(zhuǎn)移至另一50 mL具塞聚丙烯離心管中。原玻璃試管中再加入1 mL甲醇，9 mL水，混勻，轉(zhuǎn)移至同一50 mL具塞聚丙烯離心管中，混合均勻后4 ℃下以8 500 r/min離心5 min，收集提取液。

1.3樣品的凈化

微囊藻毒素-LR、RR和YR為相似結(jié)構(gòu)的環(huán)狀七肽化合物，其中YR和LR易生成單電荷分子離子(M+H)+，RR由于含有2個(gè)精氨酸結(jié)構(gòu)，易生成雙電荷分子離子(M+2H)2+，分子極性較大，因此選用ESI電離模式。用注射泵將3種微囊藻毒素分別以10 μL/min的速度直接注入離子源，ESI正離子模式掃描。一級(jí)質(zhì)譜分析(Q1掃描)顯示，LR和YR形成了穩(wěn)定的995.6和1 045.5(m/z)的(M+H)+準(zhǔn)分子離子，RR形成了穩(wěn)定的519.9(m/z)的(M+2H)2+雙電荷離子峰?？赡艿馁|(zhì)譜裂解機(jī)理如圖2所示：

1.4色譜條件

微囊藻毒素分子離子的氫正離子轉(zhuǎn)移至甲氧基上，形成氧正離子，然后發(fā)生α斷裂，C-C鍵斷開(kāi)，形成m/z135的子離子。此離子可能發(fā)生分子內(nèi)的氫轉(zhuǎn)移重排，形成更穩(wěn)定的共軛正離子。

發(fā)布校園信息公告。清華大學(xué)圖書(shū)館的網(wǎng)中在公告里滾動(dòng)展示慕課課程宣傳，讓用戶(hù)獲取學(xué)科信息資源多了一條新途徑。擴(kuò)大了宣傳的范圍，能夠吸引更多使用者的注意。

表1　流動(dòng)相梯度洗脫條件

1.5質(zhì)譜條件

船舶軸系校中技術(shù)分為靜態(tài)校中和動(dòng)態(tài)校中兩種。靜態(tài)校中技術(shù)又可分為直線(xiàn)校中、軸承上允許負(fù)荷校中和軸系合理校中三種方法。在船舶修理和建造過(guò)程中，軸系用直線(xiàn)校中時(shí)常采用三種方法，即用光學(xué)儀器校中法、按連接法蘭上規(guī)定的偏中值校中法和用樣軸校中法。

電噴霧離子源(ESI)；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；離子源溫度550 ℃；離子源電壓5 500 V；霧化氣、氣簾氣、輔助氣和碰撞氣均為高純氮?dú)狻Ｙ|(zhì)譜優(yōu)化條件見(jiàn)表2。

表2　3種微囊藻毒素的質(zhì)譜優(yōu)化條件

*表示定量離子。*indicates the quantitative ions.

2結(jié)果與討論

2.1提取溶劑的選擇

新周期的奧運(yùn)備戰(zhàn)工作正如火如荼地進(jìn)行，不管是東京奧運(yùn)會(huì)還是北京冬奧會(huì)，都讓無(wú)數(shù)的運(yùn)動(dòng)健兒們以最大努力準(zhǔn)備迎接光輝時(shí)刻?；I辦好北京冬奧會(huì)、冬殘奧會(huì)是十九大報(bào)告中提出的要求，也是體育強(qiáng)國(guó)的重要體現(xiàn)。隨后而來(lái)的也將是新一輪的退役風(fēng)暴，在新舉國(guó)體制的背景下，多方力量尚未形成完善的合作機(jī)制，這加大了退役安置保障工作的壓力。退役運(yùn)動(dòng)員的價(jià)值該如何體現(xiàn)，依然是退役安置保障工作的相關(guān)職能部門(mén)面臨的重要課題。

2.2凈化條件的選擇

水產(chǎn)品的凈化一般采用C8、C18、MCX和HLB等固相萃取柱，方法考察了這4種萃取柱的凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用HLB固相萃取小柱凈化時(shí)回收率最高，特異性好，能夠有效去除雜質(zhì)干擾。這可能是由于微囊藻毒素易溶于水和醇，分子結(jié)構(gòu)中有大量的氨基[9-10]。洗脫溶液也是影響目標(biāo)物回收率的重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)考察了不同比例的甲醇-水溶液作為洗脫液時(shí)的回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)洗脫溶液中甲醇含量低于40%時(shí)，3種微囊藻毒素回收率均較低；隨著甲醇比例增大，回收率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)甲醇含量不低于80%時(shí)，3種微囊藻毒素回收率穩(wěn)定在85.2%～94.3%，因此本文選擇80%甲醇作為洗脫溶液。

2.3色譜條件優(yōu)化

1.微囊藻毒素RR；2.微囊藻毒素YR；3.微囊藻毒素LR1.microcystin-RR；2.microcystin-YR；3.microcystin-LR圖1　3種微囊藻毒素混合標(biāo)樣優(yōu)化前后的MRM色譜圖(甲醇-水體系(左)和乙腈-水體系(右))Fig.1　The MRM chromatogram of 3 microcystins before(left:CH3OH-H2O System) andafter(right:CH3CN-H2O System) optimizing the mobile-phase

本方法考察了C8，C18，HSS C18，HSS T3色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)HSS T3色譜柱分離效果最好。同時(shí)比較了甲醇/水體系、乙腈/水體系、甲醇/0.1%甲酸、乙腈/0.1%甲酸、甲醇/0.1%乙酸銨、乙腈/0.1%乙酸銨體系作為流動(dòng)相的分離效果，發(fā)現(xiàn)乙腈/水體系分離效果優(yōu)于甲醇/水體系，而在水中添加甲酸有利于保持峰形和保留時(shí)間的穩(wěn)定，且有助于提高ESI正離子的電離效率，因此本方法選擇乙腈/0.1%甲酸為流動(dòng)相(圖1)。本方法研究了流動(dòng)相的洗脫比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙腈的比例從開(kāi)始的20%上升至60%即可將3種微囊藻毒素完全分離。為避免水產(chǎn)品基質(zhì)中一些保留較強(qiáng)的物質(zhì)滯留，本方法選擇在待測(cè)物完全流出后1 min內(nèi)將乙腈的比例由60%上升至95%，以便將基質(zhì)中的強(qiáng)保留干擾物質(zhì)全部洗脫。

由于水產(chǎn)品中含有大量脂肪、蛋白質(zhì)，因此提取時(shí)需選擇適當(dāng)?shù)奶崛∪軇?，以使提取物中共萃物較少。根據(jù)微囊藻毒素易溶于水、甲醇、乙腈及丙酮的特性，本文分別選擇水、甲醇、乙腈、丙酮作為提取劑。結(jié)果表明，水作為提取溶劑時(shí)，雜質(zhì)較多，基質(zhì)干擾較大，檢測(cè)低限無(wú)法滿(mǎn)足限量要求；用乙腈或丙酮提取，回收率較低；用甲醇提取效果最好，回收率高且基質(zhì)干擾小，能夠滿(mǎn)足檢測(cè)需求。因此，本方法最終選擇甲醇作為提取溶劑。

2.4質(zhì)譜條件確定及裂解機(jī)理研究

將提取液以1 mL/min左右的流速通過(guò)HLB固相萃取柱，待樣液全部流出后，用3 mL水和6 mL 20%甲醇溶液淋洗，棄去全部流出液，用80%甲醇溶液洗脫并定容至2 mL，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

圖2　微囊藻毒素可能的質(zhì)譜裂解機(jī)理Fig.2　Possible pyrolysis mechanism of microcystins in mass spectrometer

色譜柱：HSS T3色譜柱，1.8 μm，2.1 mm×100 mm；流速：0.45 mL/min；柱溫：50 ℃；進(jìn)樣量：40 μL；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸溶液，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

2.5線(xiàn)性關(guān)系及檢出限

采用基質(zhì)溶液配制濃度為2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL一系列標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),并依次進(jìn)樣，以目標(biāo)化合物的濃度值X為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的峰面積Y為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果表明，3種微囊藻毒素在2.5～50 ng/mL范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

表3　3種微囊藻毒素的回歸方程為及相關(guān)系數(shù)

以實(shí)際檢測(cè)時(shí)的信噪比(RSN)為10作為定量限，本方法的檢出限為5 ng/g。3種微囊藻毒素混合標(biāo)樣的MRM色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3　3種微囊藻毒素混合標(biāo)樣的MRM色譜圖Fig.3　The MRM chromatogram of 3 microcystins

2.6回收率與精密度試驗(yàn)

采用樣品標(biāo)準(zhǔn)添加法對(duì)不含微囊藻毒素的羅非魚(yú)、對(duì)蝦、牡蠣3種陰性樣品基質(zhì)進(jìn)行5、10、20 ng/g三水平添加回收試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明回收率范圍為85.2%～94.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.7%～8.1%，具體結(jié)果見(jiàn)表4-6。

表4　羅非魚(yú)中3種微囊藻毒素的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=8)

表5　對(duì)蝦中3種微囊藻毒素的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=8)

表6　牡蠣中3種微囊藻毒素的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=8)

羅非魚(yú)、對(duì)蝦、牡蠣樣品的3種微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)添加MRM定量離子色譜圖見(jiàn)圖3、圖4、圖5。由圖3、4、5可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)本方法凈化后，譜圖雜峰少，凈化效果好。

圖4　羅非魚(yú)樣品中3種微囊藻毒素的MRM色譜圖Fig.4　The MRM chromatogram of 3 microcystins in tilapia

圖5　對(duì)蝦樣品中3種微囊藻毒素的MRM色譜圖Fig.5　The MRM chromatogram of 3 microcystins in prawn

圖6　牡蠣樣品中3種微囊藻毒素的MRM色譜圖Fig.6　The MRM chromatogram of 3 microcystins in oysters

3結(jié)論

本方法采用甲醇提取，HLB固相萃取柱凈化，建立了水產(chǎn)品中微囊藻毒素的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測(cè)方法，方法的靈敏度高、特異性好、選擇性強(qiáng)，能滿(mǎn)足水產(chǎn)品中微囊藻毒素的檢測(cè)要求。

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Determination of Microcystin-LR，Microcystin-RR and

Microcystin-YR in Aquatic Products by means of HPLC-MS-MS

LIANG Zhen-gang1,2,XU Zhi-wei2,CHEN Yi-wei2,DENG Shi-ming1*,XU Li2

(1.College of Marine Sciences,Hainan University,Haikou 570228,China;2.Technology Center of Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau China,Haikou 570311,China)

Abstract:A HPLC-MS-MS method was developed for determining microcystin-LR,microcystin-RR and microcystin-YR in seafoods,the conditions of extraction,purification and the pyrolysis mechanism were also discussed.Methanol was used as the extraction solvent and HLB solid phase extraction column was used as the purifier.External standard method was used to quantify the target compounds with LC-MS-MS.The tested matrix included fish,prawn,oysters.The limits of detection were 5μg/kg.3 spiked levels (0.005 mg/kg,0.010 mg/kg and 0.020 mg/kg) were applied,and the average recoveries and RSDs obtained were ranged from 85.2%～99.3% and 4.7%～8.1%,respectively.As proved,this method satisfies the requirements(including sensitivity,specificity and selectivity) for determining microcystin-LR,microcystin-RR,microcystin-YR.

Key words:microcystin;HPLC-MS-MS;aquatic products

作者簡(jiǎn)介：梁振綱(1987—)，男，工程師，碩士生，食品藥品及相關(guān)產(chǎn)品分析，E-mail：362056312@163.com;*通信作者：鄧世明，教授，博士，E-mail：dsm701@126.com。

基金項(xiàng)目：海南省科技興海專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(XH201407、XH201309)

收稿日期：2015-04-27修回日期：2015-05-26

中圖分類(lèi)號(hào)：Q936

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-2286(2015)06-1069-07

梁振綱，徐志偉，陳藝瑋,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中3種微囊藻毒素含量[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，37(6)：1069-1075.