崔麗紅

[摘 ?要]食用菌污染雜菌中真菌占很大的比重，給菇農(nóng)及企業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，目前對(duì)該病害的防治有控制環(huán)境因子、藥劑防治、生物防治三方面。本文通過形態(tài)學(xué)鑒定技術(shù)結(jié)合分子生物技術(shù)，確定污染真菌的種類，為以后的生物防治奠定理論基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]食用菌;真菌病害;形態(tài)鑒定;分子鑒定

中圖分類號(hào)：TU755 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-914X（2016）24-0221-01

食用菌產(chǎn)業(yè)作為我國(guó)第六大農(nóng)作物產(chǎn)業(yè)，為人類生活飲食和國(guó)民經(jīng)濟(jì)都做出了重大貢獻(xiàn)。近年來，食用菌是一個(gè)非常重要的商品化作物。與其他國(guó)家相比，中國(guó)是種植食用菌最大及種植種類最多的國(guó)家，總計(jì)達(dá)到全世界種植面積的32%。

但在栽培期間由于各種因素使得產(chǎn)量急劇下降。 John Fletcher與Richard Gaze在蘑菇病蟲害控制一書中將蘑菇病害分為了五大類：真菌病害，細(xì)菌病害，病毒病害，昆蟲以及與蘑菇競(jìng)爭(zhēng)的霉。從某種程度講，大多數(shù)國(guó)家，真菌病害是最重要的病害，它能夠在任何時(shí)間段發(fā)生，但其數(shù)量種類嚴(yán)重多變。真菌病害不僅污染了食用菌菌棒，使之減產(chǎn)甚至顆粒無收，它自身由次級(jí)代謝產(chǎn)物所產(chǎn)生的真菌毒素造成致癌、致畸變、生物紊亂、遺傳病變及免疫破壞等作用，從而更加影響了人類對(duì)食用菌的食用和藥用價(jià)值，間接也影響了人類的身心健康問題。本文著重對(duì)食用菌真菌病害的鑒定方法進(jìn)行了闡述。

1.食用菌真菌病害的分離

1.1稀釋平板分離法：在污染菌棒上按比例取三點(diǎn)用分析天平稱取樣品1g，放入99mL蒸餾水的三角燒瓶，搖床上25℃300r/min搖15min，使樣品與無菌水混合均勻;再吸取1ml混勻的液體于新的9ml無菌水試管中，依次稀釋到105倍。對(duì)稀釋10-4、10-5樣品試管中吸取1ml液體各三次于滅菌的培養(yǎng)皿中，倒入加有乳酸的孟加拉紅培養(yǎng)基，混合均勻后封板，放入恒溫培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)。

1.2直接培養(yǎng)法：用無菌鑷子挑取病害處的樣品，放入加有乳酸的PDA培養(yǎng)基，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，隨后用單孢分離法對(duì)污染真菌進(jìn)行再次分離、培養(yǎng)。

2.食用菌真菌病害的形態(tài)學(xué)鑒定

將分離菌株接種到直徑9cm的PDA平板上，在距離接種部位2cm左右位置傾斜插入經(jīng)滅菌的蓋玻片，然后在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7天時(shí)，真菌菌絲體已覆蓋的蓋玻片上[1]。輕輕取出蓋玻片并置于載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株分生孢子梗及分生孢子著生方式、分生孢子的形態(tài)和大小。根據(jù)菌落特征及顯微形態(tài)特征進(jìn)行菌株種類鑒定。

3.食用菌真菌病害的分子生物技術(shù)鑒定

3.1菌絲體基因組DNA的提?。簩⒎蛛x獲得的純化菌株接種于鋪有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)一周，然后刮取菌絲體置于2ml的無菌離心管中。采用Fastmill-SDS法[2]提取菌絲體基因組DNA。

3.2 真菌病害rDNA的ITS和β-tubulin基因序列的PCR擴(kuò)增

將提取獲得的菌絲體基因組DNA樣品用ddH2O稀釋30倍后作為工作液，然后進(jìn)行rDNA的ITS和β-tubulin基因序列的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物分別為ITS1-F/ITS4[3]和BT2a/BT2b[4]。ITS-PCR和β-tubulin-PCR的反應(yīng)體系如下：dNTPs Mix 4.0μL，10×Buffer（含MgCl2）5.0μL，Taq酶（5U/μl）0.5μL，引物各1μL（10μmol/L），1.0μL待測(cè)DNA模板 （10ng/μL），ddH2O 37.5μL，總體積50μL。PCR反應(yīng)條件：94℃/95℃預(yù)變性5min，94℃/95℃變性1min/30sec，55℃/52℃退火45s/30sec，72℃延伸1.5min/1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10min，于4℃保存。

3.3 系統(tǒng)發(fā)育數(shù)的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送交生工（上海）生物工程股份有限公司測(cè)序，將獲得的序列登錄GenBank獲得登錄號(hào)，經(jīng)Genbank上Blastn序列比對(duì)，用Clustal、BioEdit軟件對(duì)序列進(jìn)行匹配和手動(dòng)矯正，最后使用MEGA6軟件中的NJ法通過重復(fù)1000次自展法（Bootstrap）檢驗(yàn)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

4. 拮抗實(shí)驗(yàn)

在凍存管中保存分離的真菌病害菌種，通過打孔器在分離該雜菌的PDA打一菌餅，實(shí)驗(yàn)室保存的土壤真菌和食用菌菌種也使用同樣的打孔器打一大小相同的菌餅。隨后把各個(gè)菌餅放至新的PDA培養(yǎng)基上（三者之間各自距離3cm左右），做三個(gè)平行組。培養(yǎng)一個(gè)星期之后找出生防菌（土壤真菌），它對(duì)雜菌進(jìn)行抑制而對(duì)食用菌菌種無影響作用。

食用菌病害嚴(yán)重危害食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，尤為嚴(yán)重的是為了預(yù)防食用菌病害的發(fā)生，大量噴灑農(nóng)藥制劑、化學(xué)制劑，致使殘留量超出出口各國(guó)的農(nóng)藥最大殘留限量（MRL）標(biāo)準(zhǔn)，影響食用菌的進(jìn)出口問題。對(duì)食用菌產(chǎn)業(yè)病害問題，從最基礎(chǔ)的病害鑒定著手，為以后食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、生物，防治及食用菌病害的研究奠定理論基礎(chǔ)。

近來不少學(xué)者通過在土壤、植物等環(huán)境中篩選對(duì)食用菌雜菌病害有拮抗作用的細(xì)菌、放線菌或真菌生物進(jìn)行生物防治，而對(duì)食用菌自身沒有任何影響。有學(xué)者研究出枯草芽孢桿菌對(duì)木霉菌有抑菌效果，放線菌對(duì)綠色木霉有一定抑制作用。該項(xiàng)防治方法安全可靠并且對(duì)環(huán)境、人類各方都無害，是最理想的。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉永紅.半夏塊莖與細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立及主要生物堿的代謝調(diào)控研究.西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

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[4] Glass N L， Donaldson G C. Development of primer sets designed for use with the PCR to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes. Applied and Enviromental Microbiology， 1995， 61（4）：1323-1330.