肇 欣，孫振剛，張 偉，華瑞年*

(1.遼寧師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，遼寧大連 116029;2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600)

1 引 言

自從上世紀(jì)90年代以來，由于化學(xué)、物理和材料在納米領(lǐng)域的快速發(fā)展，導(dǎo)致了“納米科學(xué)和納米科技”這一新興學(xué)科的出現(xiàn)。作為21世紀(jì)的關(guān)鍵性技術(shù)，納米技術(shù)涉及到多學(xué)科交叉的研究領(lǐng)域。在這一領(lǐng)域中，尤其是高質(zhì)量的單分散無機(jī)納米晶對(duì)形貌和比表面積的性質(zhì)依賴，以及這一性質(zhì)在光學(xué)、催化、生物傳感和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)上的應(yīng)用已經(jīng)得到了極大的發(fā)展。稀土離子獨(dú)特的4f電子結(jié)構(gòu)使稀土納米材料具有很多獨(dú)特的性質(zhì)。稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料(Upconversion nanoparticles，UCNPs)已成為當(dāng)前發(fā)光學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［1-2］。

稀土摻雜氟化物上轉(zhuǎn)換納米發(fā)光材料具有毒性小、自熒光背景低、發(fā)射峰窄、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，在紅外光光催化、光動(dòng)力學(xué)治療、熒光探針和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［3-7］。傳統(tǒng)的熒光探針(如有機(jī)顏料)由于采用短波激發(fā)光源和相對(duì)較高的熒光漂白速率，因而具有較高的背景熒光并只能用于短時(shí)間內(nèi)的成像［8］。與傳統(tǒng)發(fā)光標(biāo)記物相比，UCNPs具有化學(xué)穩(wěn)定性好、毒性低、發(fā)光強(qiáng)度高和Stokes位移大等優(yōu)點(diǎn)。另外，UCNPs的激發(fā)光為紅外光，不會(huì)損傷生物體也不會(huì)激發(fā)出背景熒光，信噪比高，非常有利于活體生物成像［9-11］。NaYF4是近年來發(fā)現(xiàn)的一種理想的上轉(zhuǎn)換基質(zhì)材料，具有較低的聲子能量，能降低多聲子弛豫率，提高上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率，稀土氟化物β-NaYF4被公認(rèn)為是一種優(yōu)質(zhì)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料［12-14］。2010 年，喻學(xué)峰等［15］合成了一系列大半徑稀土離子(La3+、Ce3+、Pr3+、Nd3+、Sm3+、Eu3+和Gd3+等)摻雜的水溶性六方相NaYF4納米棒，六方相 NaYF4∶(Yb，Er)/La 和 NaYF4∶(Yb，Er)/Ce納米棒表現(xiàn)出比立方相更高的上轉(zhuǎn)換熒光效率。在目前報(bào)道的所有 UCNPs中，NaYF4∶Yb，Er/Tm的上轉(zhuǎn)換效率是最高的?？梢杂糜谏餀z測(cè)的上轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記物也主要是 Yb/Er和Yb/Tm共摻雜的NaYF4納米粒子。NaYF4屬于多晶型的復(fù)合稀土氟化物，具有亞穩(wěn)相——立方相(α-NaYF4)和穩(wěn)定相——六方相(β-NaYF4)兩種晶體結(jié)構(gòu)。六方相 NaYF4∶Yb，Er/Tm相對(duì)于其立方相材料，上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率要高一個(gè)數(shù)量級(jí)。

本文利用一步水熱法合成出氨基表面修飾、單分散性好、尺寸小、發(fā)光性能優(yōu)異的水溶性β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+上轉(zhuǎn)換納米棒，用X射線粉末衍射儀(XRD)、掃描電子顯微鏡 (SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)和熒光光譜(PL)等手段對(duì)制備的樣品進(jìn)行了表征，并通過戊二醛法將BSA生物分子與所制備的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+上轉(zhuǎn)換納米棒成功偶聯(lián)。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 試劑

分析純氯化鈉(NaCl)、無水乙醇(C2H5OH)、氟化銨(NH4F)、聚乙烯亞胺(PEI)、牛血清蛋白(BSA)、戊二醛(25%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、磷酸(H3PO4)、考馬斯亮藍(lán)(G-250)、磷酸氫二鈉Na2HPO4·12H2O和磷酸二氫鈉 NaH2PO4·12H2O等均購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。Y2O3(99.99%)、Gd2O3(99.99%)、Yb2O3(99.99%)和 Er2O3(99.99%)均購于上海第二化學(xué)試劑廠。氯化釓(GdCl3·6H2O)、氯化鐿(YbCl3·6H2O)、氯化釔(YCl3·6H2O)和氯化鉺 (ErCl3·6H2O)均為自制，即將相應(yīng)的稀土氧化物溶于6 mol/L HCl中，重結(jié)晶4次獲得。

2.2 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒的制備

稱取0.058 4 g NaCl(1 mmol)、0.115 2 g YCl3·6H2O(0.38 mmol)、0.077 5 g YbCl3·6H2O(0.20 mmol)、0.007 63 g ErCl3·6H2O(0.02 mmol)和0.148 6 g GdCl3·6H2O(0.40 mmol)溶于10 mL去離子水中得到溶液A，再稱取0.296 0 g NH4F(8 mmol)溶于10.0 mL去離子水中得到溶液B，量取10mL質(zhì)量濃度為0.05 g/mL的PEI溶液和30 mL無水乙醇混合在50 mL燒杯中得到溶液C。在不斷攪拌下，將溶液C緩慢滴加到溶液A中。攪拌30 min后，再將溶液B緩慢滴加到其中，10 min內(nèi)完成滴加，再緩慢勻速攪拌20 min。將上述溶液倒入100 mL不銹鋼反應(yīng)釜，放在烘箱中，溫度調(diào)至200℃，加熱8 h后，關(guān)閉烘箱，取出反應(yīng)釜，自然冷卻至室溫。將產(chǎn)物在9 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，用無水乙醇洗滌4次，獲得的沉淀在80℃下干燥，得到的白色粉末即為表面有氨基修飾的水溶性β-NaY0.38Gd0.4F4∶20%Yb3+，2%Er3+納米棒。

2.3 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+與 BSA 偶聯(lián)產(chǎn)物的制備

準(zhǔn)確稱取10 mg所制備的 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒溶解在2.0 mL去離子水中，超聲分散30 min后，在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心，上清液倒出以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用。將有少量沉淀的離心管放入烘箱中，干燥后稱其質(zhì)量，用于計(jì)算溶解于水中的樣品的質(zhì)量。將1 mg的BSA加入到上清液中，在室溫下攪拌2 h后，再將0.10 mL戊二醛(25%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))滴加到上述溶液中，在室溫下緩慢攪拌5 h。將產(chǎn)物在9 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心，并用磷酸緩沖溶液(10 mmol/L，pH=7.4)洗滌3次，最后定容在2.0 m L的磷酸緩沖溶液中。

2.4 實(shí)驗(yàn)儀器

日本島津公司產(chǎn)XRD-6000型X射線粉末衍射儀，銅靶(λ=0.154 06 nm);日本日立公司產(chǎn)S-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡;日本電子公司JEM-2010型透射電子顯微鏡;日本Horiba公司產(chǎn)SZ-100-Z型激光粒度分析儀;日本日立公司F-4600型熒光光譜儀;日本島津UV-2450紫外光譜儀;上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)UV-6100紫外-可見分光光度計(jì)。摩爾分?jǐn)?shù)為40%條件下制得的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒樣品的粉末X射線衍射(XRD)譜。從圖中可以看出，β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒的衍射峰與β-NaYF4的標(biāo)準(zhǔn)卡片完全一致，沒有出現(xiàn)其他雜質(zhì)峰，表明產(chǎn)物物相純凈、結(jié)晶良好。在該反應(yīng)條件下，如果不引入大半徑的Gd3+，產(chǎn)物為 α-NaYF4和 β-NaYF4混相產(chǎn)物;隨著Gd3+離子摻雜量的增大(至Gd3+的摩爾分?jǐn)?shù)到30%)，仍得不到純相的 β-NaYF4(產(chǎn)物為 β-NaYF4和少量的α-NaYF4)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)引入一定量大半徑的Gd3+后，在較短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，有利于α-NaYF4向β-NaYF4相轉(zhuǎn)變，并最終獲得純相的β-NaYF4納米棒。

3 結(jié)果與討論

3.1 物相結(jié)構(gòu)分析

圖1為反應(yīng)溫度200℃、反應(yīng)時(shí)間8 h、Gd3+

圖1 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒的XRD譜Fig.1 XRD pattern ofβ-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+nanorods

3.2 形貌分析

在室溫下，通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡對(duì)合成的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒的形貌進(jìn)行了觀測(cè)，如圖2所示。

從圖2可以看出，β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+樣品的形貌為規(guī)則的實(shí)心六棱柱型納米棒，截面粒徑平均約為40 nm，平均長度約為210 nm。偶聯(lián)BSA后的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+表面覆蓋了一層物質(zhì)，因此形貌發(fā)生了變化，但粒徑大小沒有發(fā)生明顯改變。

3.3 熒光光譜分析

圖3是在980 nm激發(fā)下的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒的上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜。譜圖顯示了4個(gè)明顯的發(fā)射帶，發(fā)射中心位于407，529，546，660 nm，分別對(duì)應(yīng)于2H9/2→4I15/2、2H11/2→4I15/2、4S3/2→4I15/2和4F9/2→4I15/2躍遷。圖 4 是 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒的上轉(zhuǎn)換發(fā)光機(jī)理圖。Er3+的基態(tài)能級(jí)是4I15/2，當(dāng)用980 nm的紅外激光器激發(fā)樣品時(shí)，電子躍遷至4I11/2能級(jí)，Yb3+發(fā)生2F7/2→2F5/2躍遷，激發(fā)到2F5/2能級(jí)的電子通過聲子參與的非共振能量轉(zhuǎn)移把能量轉(zhuǎn)到Er3+的4I11/2能級(jí)上。Er3+可吸收第2個(gè)光子或吸收鄰近已處于2F5/2能級(jí)的電子的能量，再次躍遷至2H11/2和4S3/2能級(jí)，返回基態(tài)能級(jí)4I15/2時(shí)分別發(fā)出529 nm和546 nm的綠光;另有一部分到達(dá)4S3/2能級(jí)的電子經(jīng)無輻射躍遷至4F9/2能級(jí)，由4F9/2能級(jí)返回基態(tài)時(shí)發(fā)出660 nm的紅光。

圖2 樣品 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+的SEM 照片(a)和透射電鏡照片(c)，β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+偶聯(lián)BSA后的SEM照片(b)及β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+的粒徑分析圖(d)。Fig.2 SEM image(a)and TEM image(c)ofβ-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+，SEM image(b)ofβ-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+conjugated with BSA，and particle size distribution ofβ-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+(d).

圖4 β-NaYF4∶Yb3+/Er3+的上轉(zhuǎn)換發(fā)光機(jī)理圖Fig.4 Upconversion luminescence mechanism diagram ofβ-NaYF4∶Yb3+/Er3+

圖3 樣品 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+的熒光譜 (λex=980 nm)Fig.3 Fluorescent spectrum ofβ-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+(λex=980 nm)

3.4 紫外光譜分析

作為有機(jī)功能分子，聚乙烯亞胺(PEI)被選作修飾β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒表面的有機(jī)功能分子。因PEI結(jié)構(gòu)中含有氨基，并且可進(jìn)一步與BSA偶聯(lián)。PEI修飾的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒能夠很好地分散在水溶液中(溶解度約為1 mg/mL)，其表面氨基的存在非常適合于生物和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。圖5的紫外-可見吸收光譜進(jìn)一步證實(shí)了 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒樣品已與BSA成功偶聯(lián)。在BSA的紫外標(biāo)準(zhǔn)光譜中，位于276 nm和208 nm的峰被指認(rèn)為BSA中的色氨酸殘基和肽鍵的吸收峰。在 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI-BSA 的紫外光譜中也可以觀察到276 nm和208 nm處的吸收峰，然而在 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI的紫外光譜中卻沒有出現(xiàn)這兩個(gè)吸收峰。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)了BSA與β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI納米棒的成功偶聯(lián)。

3.5 考馬斯亮藍(lán)法定量分析蛋白含量

用布拉德福德試劑(100 mg的考馬斯亮藍(lán)G-250在50 mL的95%乙醇中溶解，然后加入120 mL的85%磷酸，用水稀釋至1.0 L)與BSA發(fā)生顏色反應(yīng)，進(jìn)一步定量地驗(yàn)證 BSA是否與 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI納米棒偶聯(lián)。考馬斯亮藍(lán)G-250是一種甲基取代的三苯基甲烷，分子中含磺酸基的藍(lán)色染料，在465 nm處有最大的吸收值。因此，布拉德福德試劑能吸收465 nm可見光，布拉德福德試劑與BSA蛋白結(jié)合物可以吸收595 nm可見光，其吸光度值與蛋白質(zhì)含量成正比。這種變化通過紫外光譜分析法可以用來量化樣品中BSA蛋白的含量。

首先，配制BSA的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL 的 BSA 溶液各1.00 mL。然后，向上面的BSA溶液中分別加入5.00 mL的布拉德福德試劑。2 min后，用布拉德福德試劑-BSA偶聯(lián)物的蛋白質(zhì)溶液在595 nm處進(jìn)行吸光度的測(cè)定，測(cè)定的值依次為0，0.145，0.294，0.403，0.565，0.652。最后得到在0.0 ～0.1 mg/mL濃度范圍內(nèi)的吸光度與BSA的濃度的線性關(guān)系，如圖6所示?；貧w方程可以表示如下:

Y=6.6129X+0.0125，(R2=0.995 1)， (1)式中，X為BSA濃度，Y為吸光度。經(jīng)測(cè)定，樣品β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI-BSA 的吸光度為0.127，根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI表面的BSA偶聯(lián)率為1.73%(含BSA 0.017 3 mg/mL)。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步表明，BSA 與 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+@PEI納米粒子偶聯(lián)成功。

圖6 在595 nm吸收波長下，BSA的濃度與吸光度的關(guān)系曲線。Fig.6 Linear relationship between the concentration of BSA and absorbance at595 nm

4 結(jié) 論

以聚乙烯亞胺(PEI)為表面活性劑，采用水熱法，在Gd3+的摩爾分?jǐn)?shù)為40%、反應(yīng)溫度為200℃、時(shí)間為8 h的條件下制得了純相的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒。納米棒的平均截面粒徑約為40 nm，平均長度約為210 nm。偶聯(lián)BSA后的β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+表面覆蓋了一層物質(zhì)，因此形貌發(fā)生了變化，但粒徑大小沒有發(fā)生明顯改變。當(dāng)用980 nm波長激發(fā)樣品后，β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒的上轉(zhuǎn)換光譜中出現(xiàn)了4個(gè)明顯的發(fā)射帶，發(fā)射中心位于 407，529，546，660 nm，分別對(duì)應(yīng)于2H9/2→4I15/2、2H11/2→4I15/2、4S3/2→4I15/2和4F9/2→4I15/2躍遷。采用戊二醛法，使得蛋白(BSA)上的氨基與 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒表面的氨基牢固地鍵合在一起，并通過紫外光譜分析和考馬斯亮藍(lán)法證明了β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒與 BSA偶聯(lián)成功。根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法算出 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒與 BSA的偶聯(lián)率為1.73%(0.017 3 mg/mL)。該研究為將 β-NaY(Gd)F4∶Yb3+/Er3+納米棒應(yīng)用于生物分子分析、細(xì)胞標(biāo)記及成像提供了實(shí)驗(yàn)參考。

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肇欣 (1989-)，女，遼寧沈陽人，碩士研究生，2012年于遼東學(xué)院獲得學(xué)士學(xué)位，主要從事稀土發(fā)光材料的合成與光譜性質(zhì)方面的研究。

E-mail:737547805@qq.com

華瑞年 (1965-)，男，吉林九臺(tái)人，教授，2003年于東北師范大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事稀土發(fā)光材料的合成、光譜性質(zhì)及生物利用方面的研究。

E-mail:rnhua@dlnu.edu.cn

孫振剛 (1963-)，男，黑龍江肇源人，教授，2000年于東北師范大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事新型金屬有機(jī)膦酸鹽配位聚合物的設(shè)計(jì)合成、結(jié)構(gòu)表征和性能的研究。

E-mail:szg188@163.com