叢林 夏志寬 李海濤 楊蓉婭（北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍皮膚損傷修復(fù)研究所，北京100700）

RAW264．7小鼠巨噬細胞與阿薩希毛孢子菌相互作用后TNF?α、IL?1β和CCL3的表達變化

叢林 夏志寬 李海濤 楊蓉婭
（北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍皮膚損傷修復(fù)研究所，北京100700）

【摘要】目的 研究RAW264．7小鼠巨噬細胞與T．a(chǎn)sahii相互作用后TNF?α，IL?1β和CCL3的表達水平變化。方法RAW264．7細胞與T．a(chǎn)sahii菌液共孵育3 h、6 h、9 h、12 h，對照組不加菌液。在各孵育時間點取上清液，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒檢測上清液中TNF?α、IL?1β和CCL3的含量。臺盼藍拒染法計各孵育時間點RAW264．7細胞的活細胞數(shù)。結(jié)果 RAW264．7細胞與T．a(chǎn)sahii共孵育3 h、6 h、9 h、12 h后，TNF?α、IL?1β、CCL3的表達水平均明顯高于對照組，有顯著性差異（P＜0．05）。3種細胞因子的表達水平隨共孵育時間延長而增高，共孵育9 h的表達水平最高。RAW264．7細胞的活細胞數(shù)隨共孵育時間延長而逐漸下降，共孵育12 h后的活細胞數(shù)量與其他各時間點有統(tǒng)計學差異（P＜0．05）。結(jié)論 RAW264．7小鼠巨噬細胞面臨T．a(chǎn)sahii感染時可分泌TNF?α、IL?1β、CCL3等細胞因子，這些炎性細胞因子可能參與了抗T．a(chǎn)sahii感染的免疫反應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】巨噬細胞；阿薩希毛孢子菌；細胞因子

［Chin J Mycol，2015，10（4）：203?206］

阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T．a(chǎn)sa?hii）是播散性毛孢子菌病的主要病原菌，可導(dǎo)致系統(tǒng)性、播散性感染。2001年楊蓉婭等［1］報道了國內(nèi)首例播散性毛孢子菌病。播散性阿薩希感染主要見于免疫缺陷宿主，致死率高，近10 a其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢［2］，但是關(guān)于T．a(chǎn)sahii的感染機制及宿主的防御機制目前研究較少。

我們前期應(yīng)用全基因組芯片研究了人THP?1單核細胞與T．a(chǎn)sahii體外作用的早期轉(zhuǎn)錄譜變化。結(jié)果顯示，THP?1細胞與T．a(chǎn)sahii體外作用3 h后，有大量基因表達上調(diào)，上調(diào)的基因主要涉及固有免疫、炎癥反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗凋亡等生物學過程［3］。這說明固有免疫細胞在遭遇阿薩希毛孢子菌感染時可啟動固有免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗感染作用。

為進一步研究宿主免疫細胞在抗T．a(chǎn)sahii感染中的作用，我們研究了RAW264．7小鼠巨噬細胞與T．a(chǎn)sahii相互作用后炎性細胞因子的表達變化，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1．1材料

細胞 RAW264．7小鼠巨噬細胞株購買自中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院細胞中心。

菌株 T．a(chǎn)sahii菌株購買自荷蘭真菌菌種保藏中心保存的T．a(chǎn)sahii標準株（編號CBS2479）。經(jīng)API20C系統(tǒng)生化鑒定及DNA序列分析驗證（AS2．2174）。

主要試劑 胎牛血清（FBS，美國Hyclone公司）、DMEM高糖液體培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）、磷酸鹽緩沖液（PBS，美國Hyclone公司）、細胞消化液（0．25%胰蛋白酶?EDTA，碧云天生物技術(shù)有限公司）、DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）、鏈霉素100 μg／mL和青霉素100 μg／mL（碧云天生物技術(shù)有限公司）。臺盼藍染料（美國sigma公司）。

1．2方法

T．a(chǎn)sahii的傳代、培養(yǎng) 將?80℃保存的T．a(chǎn)sa?hii標準株接種于沙式瓊脂培養(yǎng)基，復(fù)蘇活化后轉(zhuǎn)種于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r／min搖床培養(yǎng)12 h，使其形成含95%孢子（包括芽生孢子和關(guān)節(jié)孢子）的菌懸液，6 000 r／min離心5 min收集孢子，PBS洗滌3次，劇烈振蕩使之形成單個孢子懸液，調(diào)整細胞數(shù)到1×106個／mL。

RAW264．7細胞的傳代、培養(yǎng) RAW264．7細胞用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期的細胞，用0．25%胰酶?EDTA消化，制備分散均勻的單細胞懸液，臺盼藍拒染法計活細胞數(shù)＞95%，調(diào)整細胞濃度至1×105個／mL。

共培養(yǎng)體系 將1×105個／mL的RAW264．7細胞接種于96孔板，每孔100 μL。實驗組加入100 μL濃度為1×106個／mL的T．a(chǎn)sahii菌液（細胞∶菌＝1∶10），37℃，5%CO2共孵育3 h、6 h、9 h、12 h。對照組不加菌液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h、6 h、9 h、12 h。在各孵育時間點取上清液，轉(zhuǎn)移到另一96孔板，置于?80℃冰箱待檢。用DMEM液體培養(yǎng)基清洗2遍去除殘留的菌液，臺盼藍拒染法計RAW264．7細胞的活細胞數(shù)，至少計數(shù)100個細胞。

上清液中細胞因子的檢測 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），嚴格按照ELISA試劑盒（美國R＆D公司）說明書操作，首先用標準品繪制出標準曲線，得出線性回歸方程，再將各組所測出的A值帶入方程中，計算出樣品中TNF?α、IL?1β、CCL3的含量，每樣品均設(shè)2個復(fù)孔，實驗共重復(fù)3次，檢測結(jié)果以pg／mL表示。

1．3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18．0軟件進行統(tǒng)計學分析，ELISA結(jié)果以（x?±s）表示，用重復(fù)測量方差分析（ANO?VA）進行各組均數(shù)的兩兩比較。RAW264．7活細胞計數(shù)用（x?±s）表示，用t檢驗進行統(tǒng)計學分析。

2　結(jié) 果

RAW264．7細胞與T．a(chǎn)sahii共孵育3 h、6 h、9 h、12 h后，TNF?α、IL?1β、CCL3的表達水平均明顯高于對照組，有顯著性差異（P＜0．05）（見圖1 ～3）。

TNF?α、IL?1β、CCL3的表達水平隨共孵育時間延長而增高。共孵育9 h后3種細胞因子的表達水平最高，共孵育12 h后3種細胞因子的表達水平較共孵育9 h有所降低，但無統(tǒng)計學差異（P＞0．05），即3種細胞因子在各時間點的表達水平進行兩兩比較，除9 h與12 h無統(tǒng)計學差異外，均有顯著性差異（P＜0．05）。RAW264．7細胞與T．a(chǎn)sahii共孵育3 h、6 h、9 h、12 h，相同時間點，實驗組TNF?α、IL?1β、CCL3的表達水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學差異（P＜0．05），見表1。

RAW264．7細胞與T．a(chǎn)sahii共孵育3 h、6 h、9 h、12 h后應(yīng)用臺盼藍拒染法檢測活細胞的數(shù)量。結(jié)果顯示，RAW264．7細胞的活細胞數(shù)隨共孵育時間延長而下降，共孵育12 h后的活細胞數(shù)量與其他各時間點有統(tǒng)計學差異（P＜0．05），實驗組其余各時間點及對照組各時間點之間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0．05），見表2。

3　討 論

T．a(chǎn)sahii進入宿主體內(nèi)后是否致病，是由宿主的免疫防御狀態(tài)和菌株致病力兩個因素決定的。國際上報道由T．a(chǎn)sahii所致的播散性毛孢子菌病大多數(shù)發(fā)生于惡性血液病等免疫功能缺陷人群中［4］?？梢姡芯克拗鲗Π⑺_希毛孢子菌的免疫防御機制對于探求播散性毛孢子菌病發(fā)病機制非常重要。

圖1　RAW264．7細胞?與T．a(chǎn)sahii共孵育3 h、6 h、9 h、12 h后，TNF?α的表達水平均明顯高于對照組，有統(tǒng)計學差異（P＜0．05） 圖2 RAW264．7細胞?與T．a(chǎn)sahii共孵育3 h、6 h、9 h、12 h后，IL?1β的表達水平均明顯高于對照組，有統(tǒng)計學差異（P＜0．05） 圖3 RAW264．7細胞?與T．a(chǎn)sahii共孵育3 h、6 h、9 h、12 h后，CCL3的表達水平均明顯高于對照組，有統(tǒng)計學差異（P＜0．05）Fig．1 The level of TNF?α in the supernatant released by RAW264．7 cells after incubation with T．a(chǎn)sahii for 3，6，9，or 12 h was significantly higher than those in control group（P＜0．05） Fig．2 The levels of IL?1β in the supernatant released by RAW264．7 cells after incubation with T．a(chǎn)sahii for 3，6，9，or 12 h was significantly higher than those in control group（P＜0．05） Fig．3 The levels of CCL3 in the supernatant released by RAW264．7 cells after incubation with T．a(chǎn)sahii for 3，6，9，or 12 h was significantly higher than those in control group（P＜0．05）

表1　RAW264．7細胞與T．a(chǎn)sahii共孵育后上清液中TNF?α、IL?1β、CCL3的表達水平Tab．1 The levels of TNF?α，IL?1β and CCL3 in the supernatants released by RAW264．7 cells after incubation with T．a(chǎn)sahii

表2　RAW264．7細胞與T．a(chǎn)sahii共孵育后活細胞的數(shù)量Tab．2 Viable count of RAW264．7 macrophages incubated with T．a(chǎn)sahii

巨噬細胞是重要的固有免疫細胞，在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。它通過調(diào)理素（特異性抗體、補體、甘露聚糖結(jié)合蛋白）和非調(diào)理素（甘露聚糖受體、葡聚糖受體等）依賴的機制吞噬病原體，并產(chǎn)生多種效應(yīng)分子殺傷病原體，而細胞因子在抗真菌感染的過程中，起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用［5］。

TNF?α、IL?1β是宿主抗真菌免疫防御的重要細胞因子。TNF?α可增強巨噬細胞吞噬、殺傷病原真菌的功能［6］。TNF?α和IL?1β還可以誘導(dǎo)其他炎性細胞因子的分泌，發(fā)揮保護性免疫防御功能［7?8］。CCL3又叫巨噬細胞炎性蛋白1?α（MIP?1α），是一種重要的趨化因子，它可以募集炎性細胞到感染部位，通過炎性細胞及其分泌的細胞因子發(fā)揮抗感染作用。CCL3已被證實在中性粒細胞減少的宿主免疫細胞對抗侵襲性肺曲霉病發(fā)揮重要作用［9］。

本課題組前期報道了人THP?1單核細胞對T．a(chǎn)sahii感染的早期轉(zhuǎn)錄譜反應(yīng)，人THP?1細胞與T．a(chǎn)sahii相互作用3 h后，有463個基因表達明顯上調(diào)；生物信息學分析提示表達上調(diào)基因主要涉及固有免疫、炎癥反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗凋亡等生物學過程，其中上調(diào)幅度最大的主要是TNF?α等炎性細胞因子［2］。

研究表明，不同的病原真菌對固有免疫細胞分泌細胞因子的影響不同。蔣麗等［10］研究了Fonse?caea monophora對巨噬細胞TLR2、TLR4、Dectin?1 和TNF?α表達的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn)．monophora分生孢子突變株（色素株，CBSl22845）可以通過抑制TNF?α分泌來抑制炎癥反應(yīng)，維持菌體在巨噬細胞中的長期生存和繁殖。而我們的實驗結(jié)果與前期的轉(zhuǎn)錄譜研究一致，并在不同種屬中證實了宿主單核／巨噬細胞面臨T．a(chǎn)sahii感染時可分泌TNF?α、IL?1β、CCL3等細胞因子，形成強大的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抗真菌感染的免疫防御作用，也說明T．a(chǎn)sa?hii對宿主免疫細胞分泌炎性細胞因子可能沒有抑制作用。此實驗結(jié)果與T．a(chǎn)sahii所致播散性毛孢子菌病臨床罕見的情況相符。實際上，在免疫正常人群中，宿主的固有免疫細胞可通過其吞噬、殺傷功能及分泌細胞因子等炎性介質(zhì)，發(fā)揮清除病原真菌的作用，這也許正是播散性毛孢子菌病發(fā)病率很低的原因。

在本實驗采用的細胞／菌比例下，RAW264．7細胞的活細胞數(shù)隨共孵育時間延長而下降，提示T．a(chǎn)sahii大量繁殖時對RAW264．7細胞的活力有一定影響。而TNF?α、IL?1β、CCL3的表達水平在共孵育12 h后較共孵育9 h有所下降，我們推測，這可能與RAW264．7細胞的活細胞數(shù)量在共孵育12 h后明顯下降導(dǎo)致細胞因子分泌減少有關(guān)，而分泌在上清液中的細胞因子也可能隨時間延長而部分失活。

研究宿主和病原真菌的相互作用，可加深對病原真菌感染的致病機制及宿主防御機制的理解，而宿主與病原真菌的相互作用復(fù)雜。本實驗僅為小鼠巨噬細胞與T．a(chǎn)sahii相互作用的初步研究，宿主固有免疫細胞在抵抗T．a(chǎn)sahii感染中的免疫防御機制尚需進一步實驗研究。

參考文獻

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［本文編輯］ 王 飛

·論著·

Expression of TNF?α，IL?1β and CCL3 in RAW264．7 macrophages challenged with Trichosporon asahii

CONG Lin，XIA Zhi?kuan，LI Hai?tao，YANG Rong?ya
（Department of Dermatology，General Hospital of Beijing Military Command，Beijing 100700，China）

【Abstract】Objective To explore the protein levels of TNF?α，IL?1β and CCL3 in RAW264．7 macrophages challenged with Tri?chosporon asahii（T．a(chǎn)sahii）．Methods RAW264．7 macrophages were incubated with T．a(chǎn)sahii or medium alone（control group）for 3，6，9，or 12 h，then the cytokine concentrations（TNF?α，IL?1β and CCL3）in the supernatants were determined using commercial ELISA kits．The numbers of viable RAW264．7 macrophages after incubated with T．a(chǎn)sahii for 3，6，9，or 12 h were counted by using trypan blue staining method．Results The protein levels of TNF?α，IL?1β and CCL3 in the supernatants when RAW264．7 macropha?ges incubated with T．a(chǎn)sahii for 3，6，9，or 12 h were significantly higher than those in control group（P＜0．05）．The protein levels of these 3 cytokines were gradually elevated with the extension of incubation time and peaking at 9 h．The numbers of viable RAW264．7 macrophages were gradually declined with the extension of incubation time．The numbers of viable RAW264．7 macrophages were significantly declined after incubated with T．a(chǎn)sahii for 12 h（P＜0．05）．Conclusion RAW264．7 macrophages could secrete TNF?α，IL?1β and CCL3 when challenged with T．a(chǎn)sahii and these inflammatory cytokines may be involved in the anti?fungal immune response of RAW264．7 macrophages against T．a(chǎn)sahii infection．

【Key words】macrophages；Trichosporon asahii；cytokines

［收稿日期］2014?11?30

通訊作者：楊蓉婭，E?mail：yangrya＠sina．com

作者簡介：叢林，男（漢族），博士，主治醫(yī)師．E?mail：conglin369＠163．com

基金項目：國家自然科學基金（81271764，81472892）

【中圖分類號】R 379．9

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673?3827（2015）10?0203?04