石瀅 崔巖 趙莉佩 宋洋 李珊山（吉林大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科，長(zhǎng)春130021）

球形孢子絲菌DNA提取方法的比較

石瀅 崔巖 趙莉佩 宋洋 李珊山
（吉林大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科，長(zhǎng)春130021）

【摘要】目的 獲得一種高效、快速、簡(jiǎn)便的提取球形孢子絲菌DNA的方法。方法 以不同地區(qū)來(lái)源的球形孢子絲菌為實(shí)驗(yàn)材料，采用CTAB法、異硫氰酸胍法、試劑盒法、堿裂解法4種方法分別提取球形孢子絲菌DNA。通過(guò)紫外吸光度法測(cè)定DNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳、PCR擴(kuò)增評(píng)價(jià)DNA的質(zhì)量。結(jié)果 雖然不同方法均可得到球形孢子絲菌的DNA，但堿裂解法獲得DNA的濃度和純度明顯優(yōu)于其他3種方法。利用鈣調(diào)蛋白基因的引物對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，各樣本均出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，且條帶亮度較好。結(jié)論 堿裂解法是獲得高質(zhì)量球形孢子絲菌DNA的理想方法。

【關(guān)鍵詞】球形孢子絲菌；堿裂解法；CTAB法；異硫氰酸胍法；DNA提取

［Chin J Mycol，2015，10（4）：216?219］

孢子絲菌病（Sporotrichosis）是由孢子絲菌（Sporothrix spp．）引起的人畜共患的深部真菌病。新的分類鑒定法已將孢子絲菌分為由S．schenckii sensu stricto，S．globosa，S．brasiliensis，S．mexicana，S．Luriei，S．pallida等組成的復(fù)合體［1?2］，其中球形孢子絲菌（S．globosa）為我國(guó)孢子絲菌病的主要致病菌［3?4］。在以往基因分型的相關(guān)研究中，孢子絲菌病的型別、皮損表現(xiàn)及菌株的藥物敏感性、地域來(lái)源等，尚無(wú)定論［5?6］。但隨著分類的細(xì)化及AFLP、 DGGE等基因分型技術(shù)的出現(xiàn)，為解決上述問(wèn)題提供了新的思路。但獲得高質(zhì)量的DNA是進(jìn)行基因擴(kuò)增或基因分型的前提。本文通過(guò)比較真菌DNA幾種常見(jiàn)的提取方法，篩選出一種可以獲得高質(zhì)量球形孢子絲菌DNA的方法，為開(kāi)展球形孢子絲菌的相關(guān)分子實(shí)驗(yàn)提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1．1菌株來(lái)源

分別取自吉林省（FHJU 1）、江蘇?。╓HSU 4）、廣州?。⊿HZU 2）、重慶市（CQMU 1）、北京市（FHPU 3），共5株球形孢子絲菌（S．globosa），菌株由吉林大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科保存并提供。

1．2主要試劑

CTAB、異硫氰酸胍購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，酵母基因組DNA提取試劑盒（DP307）、2×Taq PCR MasterMix和DL2000購(gòu)于北京天根生化科技有限公司，上游引物（CL1：5’?GARTWCA AGGCCTTCTC?3’）和下游引物（CL2A：5’?TTTTTGCATGAGTTGG AC?3’）由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1．3菌株的培養(yǎng)與收集

挑取不同地區(qū)的球形孢子絲菌接種至PDA斜面培養(yǎng)基，于28℃活化7 d后，轉(zhuǎn)種至PDB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)72 h。取2 mL菌懸液，12 000 r／min離心15 min，收集菌體，用無(wú)菌水洗滌2次。

1．4DNA提取的方法

CTAB法［7?8］加入600 μL CTAB提取液（2% CTAB，100mM Tris，1．4M NaCl，20mM EDTA）及1%巰基乙醇，混勻，55℃水浴60 min，12 000 r／min離心5 min，收集上清液；然后加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）混勻后，12 000 r／min離心2 min，收集上清；加入1／10體積3M醋酸鈉，2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，?20℃放置60 min后，12 000 r／min離心10 min；加500 μL預(yù)冷的70%乙醇，4℃12 000 r／min離心5 min，棄上清；待乙醇揮發(fā)后，用40 μL ddH2O溶解，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

異硫氰酸胍法［9］加入500 μL GPT試劑（6M異硫氰酸胍，50mM Tris（pH8．3），50%Tris飽和酚（pH 8．0），混勻，懸浮在沸水浴中15 min；輕微離心后，加入等體積氯仿?異戊醇（24∶1）試劑，混勻后，12 000 r／min離心10 min；取上清，加入等體積異丙醇混勻，?20℃放置60 min后，12 000 r／min離心15 min，棄上清，加入500 μL預(yù)冷的70%乙醇，輕輕顛倒試管2次，12 000 r／min離心5 min，棄上清，待乙醇揮發(fā)后，用40 μL ddH2O溶解，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑盒法 參照酵母基因組DNA提取試劑盒（DP307）說(shuō)明書(shū)操作，DNA產(chǎn)物用40 μL ddH2O溶解，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

堿裂解法［10?11］加入540 μL Solution I（0．9%葡萄糖，25mM Tris，6mM EDTA，pH 8．0），混勻，加入60 μL SolutionⅡ（1%SDS，0．2M NaOH），混勻，95℃加熱10 min，加入300 μL SolutionⅢ（12% NaAc，12%冰醋酸），冰浴10 min，顛倒混勻；4℃12 000 r／min離心5 min，取上清，加入等體積異丙醇，混勻，?20℃放置60 min后；4℃12 000 r／min離心5 min，棄上清；加入200 μL 70%預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，12 000 r／min離心5 min，棄上清；待乙醇揮發(fā)后，用40 μL ddH2O溶解，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．5DNA濃度及純度的測(cè)定

分別按上述方法提取DNA后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品OD260和OD280值，以ddH2O作為對(duì)照，然后按如下公式計(jì)算：DNA樣品的濃度（μg／μL）＝OD260×稀釋倍數(shù)×50 μg／μL DNA（核酸純度的估計(jì)：OD260／OD280）。

1．6PCR擴(kuò)增

模板DNA 1 μL，上游引物和下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12．5 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件［3］為：94℃預(yù)變性1 min，94℃變性40 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5 min。PCR產(chǎn)物上樣于1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后于凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

2　結(jié)果與分析

2．1紫外吸收光譜檢測(cè)DNA含量

將4種方法提取的基因組DNA進(jìn)行紫外吸收光譜檢測(cè)（見(jiàn)表1～2），純的DNA OD260／OD280比值對(duì)是1．8，純的RNA是2．0。若比值太低（＜1．8）表明可能有酚或者蛋白質(zhì)的污染；若比值太高（＞2．0）則可能有RNA的存在。表2顯示堿裂解法所提取的DNA純度值在1．7～1．9之間；其余三種方法所提取的DNA純度值均在1．5～2．2之間；且堿裂解法所提取得DNA濃度最高，為30～60 μg／μL，其余三種方法提取的DNA濃度分別為0．4～13 μg／μL、8．0～18 μg／μL、9．0～58 μg／μL，可見(jiàn)堿裂解法提取的DNA純度和濃度都較其他三種方法好。

表1　四種方法所測(cè)各樣本DNA濃度值（?x±s）（μg／μL）Tab．1 Four methods for the concentration of the DNA（?x±s）（μg／μL）

表2　四種方法所測(cè)各樣本核酸純度值（OD值）Tab．2 Four methods for the purity of the DNA（OD value）

2．2PCR法檢測(cè)DNA質(zhì)量

將堿裂解法所提的基因組DNA進(jìn)行PCR分析，結(jié)果表明：堿裂解法擴(kuò)增條帶具有較好的特異性，且?guī)颓逦⒚髁粒ㄒ?jiàn)圖1），適于PCR擴(kuò)增。

圖1　堿裂解法提取的基因組DNA PCR產(chǎn)物電泳圖：M．Maker DL2000；Lane1?5．FHJU 1，CQMU 1，WHSU 4，F(xiàn)HPU 3，SHZU 2；Lane6．negative controlFig．1 PCR product of genomic DNA extracted by alkaline lysis

3　討 論

真菌DNA提取方法的主要區(qū)別在于細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的破壞及細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的分離，由于真菌組成成分差異較大，因此不同菌種最合適的DNA提取方法會(huì)有一定差別。白永宏等［12］曾報(bào)道食用菌羊肚菌宜采用CTAB法提取，任衍春等［13］發(fā)現(xiàn)利用蛋白酶K法提取植物病原真菌水稻紋枯菌DNA的質(zhì)量最好，而白假絲酵母菌［14］則適用于蝸牛酶法提取。可見(jiàn)對(duì)真菌樣本開(kāi)展基因鑒定、分型等相關(guān)研究之前，進(jìn)行DNA提取方法的篩選十分必要。

球形孢子絲菌的細(xì)胞壁是由幾丁質(zhì)、葡聚糖、甘露聚糖等組成，其結(jié)構(gòu)不易充分裂解。常用的破壁方法有機(jī)械法、酶法和化學(xué)法等，液氮研磨一直是最常用的機(jī)械破壁方法，但該方法對(duì)材料的要求較為苛刻，菌體不僅需要干燥，而且操作繁瑣，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)臨床樣本的快速鑒定并不適用，同時(shí)該方法在研磨過(guò)程中容易造成基因組DNA的斷裂和不完整［15］。本實(shí)驗(yàn)以液體培養(yǎng)的菌體直接作為實(shí)驗(yàn)材料，利用四種不同方法破壁，試劑盒法為酶法，其余均為化學(xué)法。結(jié)果表明四種方法均能從菌體中成功獲得基因組DNA，試劑盒法最為迅速，只需約2 h，而CTAB法所需時(shí)間最長(zhǎng)約4 h，堿裂解法和異硫氰酸胍法耗時(shí)相當(dāng)。DNA的純度和濃度檢測(cè)結(jié)果顯示，堿裂解法最優(yōu)，其次為試劑盒法，而CTAB法較差。這是由于堿裂解法中，NaOH和SDS加熱煮沸這一破壁過(guò)程，反應(yīng)比較劇烈，效果最徹底。試劑盒法選用的是酵母基因組提取試劑盒，利用溶菌酶進(jìn)行破壁的方法對(duì)于絲狀真菌可能效果并不理想。但離心管柱能特異性吸附DNA，因此該方法DNA純化的效果會(huì)優(yōu)于使用酚／氯仿／異戊醇和異丙醇沉淀法。CTAB破壁效果最差，這可能與實(shí)驗(yàn)材料有關(guān)，其更適用于液氮研磨處理的樣品。另外，堿裂解法所用試劑均為常用試劑，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)室的條件要求不高。因此，堿裂解法具有高效、簡(jiǎn)便、迅速的優(yōu)點(diǎn)，是提取球形孢子絲菌DNA的理想方法。

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［本文編輯］ 王 飛

·消息·

Comparison of DNA extraction methods from Sporothrix globosa

SHI Ying，CUI Yan，ZHAO Li?pei，SONG Yang，LI Shan?shan
（Department of Dermatology and Venereology，F(xiàn)irst Hospital of Jilin University，Changchun 130021，China）

【Abstract】Objective To find a rapid，effective and easy?to?perform DNA extraction protocol from Sporothrix globosa．Methods Four methods，such as CTAB?extraction，guanidine thiocyanate boiling?extraction，alkaline lysis?extraction，DNA extraction kit，were compared based on Sporothrix globosa isolates from different regions．The purity and yield of the DNA were determined by ultraviolet absorption spectrum．The DNA quality was evaluated with agarose gel electrophoresis and PCR amplification．Results It showed that all methods could get DNA，but alkaline lysis?extraction was better than others for the purity and yield of the DNA．Based on degener?ated primers of fragments of the calmodulin genes for PCR，we found all samples showed bright stripe．Conclusions Alkaline lysis?extraction is the most suitable method for extracting high quality DNA from Sporothrix globosa．

【Key words】Sporothrix globosa；Alkaline lysis?extraction；CTAB?extraction；Guanidine thiocyanate boiling?extraction；DNA extration

［收稿日期］2015?05?25

通訊作者：李珊山，E?mail：shansalee＠163．com

作者簡(jiǎn)介：石瀅，女（漢族），碩士研究生在讀．E?mail：442387194＠qq．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81171509）；吉林省科技廳科技創(chuàng)新人才培育計(jì)劃（20150520039JH）

【中圖分類號(hào)】R 379．9

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673?3827（2015）10?0216?04