鈕俊興，徐星宇，胡立宏

(中國科學院上海藥物研究所，中藥現(xiàn)代化中心，上海201203)

Carfilzomib:從天然產(chǎn)物到藥物的研發(fā)歷程

鈕俊興，徐星宇，胡立宏

(中國科學院上海藥物研究所，中藥現(xiàn)代化中心，上海201203)

摘要:天然產(chǎn)物及其衍生物是藥物的重要來源。Carfilzomib是一個以天然產(chǎn)物為先導通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到的用于治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物，其先導化合物Epoxomicin是從微生物中發(fā)現(xiàn)的具有抗癌活性的環(huán)氧酮肽類天然產(chǎn)物，能夠選擇性地抑制蛋白酶體，其環(huán)氧酮結(jié)構(gòu)以獨特的兩步反應和蛋白酶體共價結(jié)合，因此克服了同類藥物的脫靶缺點。以Epoxomicin為先導，通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到活性更強、成藥性性更好的Carfilzomib，作為新一代蛋白酶體抑制劑于2012年上市。

關鍵詞:蛋白酶體抑制劑; Carfilzomib; Epoxomicin

1　簡介

天然活性產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)新穎，藥理活性多樣的特點，是新藥創(chuàng)制的重要來源，臨床上有約50%的藥物直接或間接來源于天然產(chǎn)物，但大多數(shù)天然產(chǎn)物存在活性弱、特異性低、類藥性差等缺點，因此需要根據(jù)其不足，有針對性的進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。本文通過總結(jié)文獻，介紹以活性天然產(chǎn)物Epoxomicin為先導化合物，通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到上市藥物Carfilzomib的實例，從藥物化學的視角分析天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)改造的要點。

Carfilzomib(商品名Kyprolis) (結(jié)構(gòu)見圖1)是美國Onys制藥公司開發(fā)的新一代蛋白酶體抑制劑，于2012年7月20日獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準上市，主要用于曾接受過兩種或以上過往治療方案(包括Bortezomib和免疫調(diào)節(jié)劑治療)的多發(fā)性骨髓瘤患者。多發(fā)性骨髓瘤是惡性漿細胞在骨髓中克隆增生性疾病，也是一種較為罕見的致命疾病。作為一種罕見病用藥，Carfilzomib是在美國FDA加速審批程序下獲得批準的。

圖1　Epoxomicin和Carfilzomib的結(jié)構(gòu)圖

2　Epoxomicin的發(fā)現(xiàn)及作用機制

2.1作用靶點蛋白酶體是真核生物細胞內(nèi)降解蛋白質(zhì)的核心部分，是一類桶裝復合物，由1個20S核心顆粒和2個19S調(diào)節(jié)顆粒和許多多肽亞基組成。真核生物體中β1、β2、β5亞基具有水解蛋白的活性特點，其中β5亞基(糜蛋白酶樣活性)負責大部分蛋白質(zhì)的水解。蛋白酶體水解蛋白質(zhì)時，首先產(chǎn)生具有活性的蘇氨酸(Thr1)，在水傳遞電子的作用下，Thr1Oγ親核進攻肽鍵的羰基，發(fā)生水解反應。

抑制蛋白酶體的水解活性會增加毒性蛋白、激活凋亡通路、導致細胞凋亡;在增殖活躍的腫瘤細胞中，由于異常蛋白的迅速積累致使蛋白酶體高表達，蛋白酶體的活性比正常細胞中更強。因而腫瘤細胞對抑制蛋白酶體活性導致的凋亡作用更敏感，因此，蛋白酶體被認為是治療腫瘤的靶標。

2.2 Epoxomicin的發(fā)現(xiàn)來源于微生物的天然產(chǎn)物Epoxomicin(見圖1)是一個具有環(huán)氧酮結(jié)構(gòu)的天然線性多肽，于20世紀90年代，由百時美施貴寶(BMS)的東京研發(fā)部從編號Q996－17的放線菌菌株中首次分離得到［1］。盡管它在體內(nèi)、體外均表現(xiàn)出很強的抗腫瘤活性(對鼠源黑色素瘤B16－F10和白血病P388細胞株增殖抑制的IC50均為2 ng·mL－1;對BDF1小鼠B16黑色素瘤靜脈給藥的有效劑量為每天0.13 mg·kg－1)，但BMS認為其有不穩(wěn)定的環(huán)氧酮結(jié)構(gòu)和較差的類藥性質(zhì)，加之抗腫瘤機制不明確，因此放棄了進一步的研究。

2.3 Epoxomicin的作用機制與此同時，耶魯大學的Crews小組對Epoxomicin很感興趣:一方面其體外體內(nèi)抗癌活性很強;另一方面其環(huán)氧結(jié)構(gòu)可能與蛋白通過共價鍵結(jié)合，易于獲得靶蛋白，從而解釋其抗癌的作用機制。Crews小組通過全合成得到了Epoxomicin，并利用生物素標記原理合成了分子探針［2，3］，通過探針確立靶蛋白為蛋白酶體β1、β2i和β5i亞基。合成的Epoxomicin能選擇性地抑制蛋白酶體活性，不抑制其他蛋白酶如木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶等。

為了解釋Epoxomicin高度選擇性的原因，確定其與蛋白酶體結(jié)合的機理，Crews與慕尼黑理工大學的Groll合作得到了Epoxomicin和酵母菌蛋白酶體的晶體復合物［4］。通過晶體復合物發(fā)現(xiàn)Epoxomicin的羰基部分被蛋白酶體的Thr1Oγ進攻后形成半縮醛結(jié)構(gòu)復合物，這個復合物分子中親核性的Thr1N繼而親核進攻環(huán)氧，生成了6－exo－tet的嗎啉環(huán)。這樣的兩步反應使Epoxomicin和蛋白酶體通過共價鍵不可逆地緊密結(jié)合在一起(見圖2)。

圖2　Epoxomicin和蛋白酶體的結(jié)合機制

當時在研的蛋白酶體抑制劑如醛肽類、烯砜肽類、硼酸肽類等，除了和蛋白酶體以共價鍵結(jié)合外，還與其他具有親核性基團的蛋白酶如絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶結(jié)合，有不同程度的脫靶作用，使得療效較差，毒副作用較大［5］。而Epoxomicin這種通過兩步反應形成共價鍵的機制，決定了它對具有獨特Thr1結(jié)構(gòu)的蛋白酶體有特異選擇性，優(yōu)于以往的蛋白酶體抑制劑，具有潛在成藥性。

3　Epoxomicin的結(jié)構(gòu)優(yōu)化

因為Epoxomicin表現(xiàn)出了很強的蛋白酶體β5亞基的選擇性抑制活性，所以Crews小組期望通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到蛋白酶體抑制活性和抗癌活性更強、成藥性更好的候選藥物。Epoxomicin的結(jié)構(gòu)可分為兩個部分(見圖3) :環(huán)氧酮部分和四肽部分(四肽部分根據(jù)與蛋白酶體水解位點的距離分別為P1～P4)，下面分別對它們進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。

圖3　多肽結(jié)構(gòu)示意圖

3.1環(huán)氧酮部分的改造由上文的作用機制可以看出，Epoxomicin的環(huán)氧結(jié)構(gòu)是進行共價結(jié)合的活性必須基團。同時早期研究也表明，環(huán)氧結(jié)構(gòu)為2R構(gòu)型時有活性，而為2S構(gòu)型時則活性降低或消失［6］，說明具有一定立體構(gòu)型的環(huán)氧片段是保持活性所必需的，因而不對該部分進行改造。

3.2肽鏈的長度與活性的關系相關研究表明:蛋白酶體的20S催化亞基中的多個口袋，可以與多肽的側(cè)鏈發(fā)生相互作用，而P1片段是該類4肽衍生物與蛋白酶體結(jié)合的關鍵位置［7］。當P1區(qū)域為亮氨酸或苯丙氨酸時，可以有效提高對β5亞基的選擇性;而為堿性片段如賴氨酸和精氨酸時，β5亞基的選擇性降低［8，9］。

因此，研發(fā)人員首先將R1～R4的取代基都改為異丁基，設計并合成化合物1～4，考察活性與鏈長的關系(見表1)。

表1　肽鏈長度與蛋白酶體不同亞基抑制活性關系

結(jié)果表明，肽鏈為四肽長度時，選擇性和活性都最佳，肽鏈長度的縮短將導致活性和選擇性的下降，推測可能與蛋白酶體催化位點口袋尺寸有關。

3.3 R2～R4取代基的優(yōu)化在確定了四肽環(huán)氧酮為基本骨架后，研究人員以化合物1為基礎，通過改變P2、P3、P4片段的氨基酸種類來探究其對活性的影響(見表2)。

表2　化合物5～15對蛋白酶體不同亞基抑制活性

續(xù)表2:

首先保持R3、R4都為異丁基，改變R2的取代基，得到化合物5～7。體外活性測試表明，R2基團為脂肪族取代基，活性較差;為芳香性取代基時，對酶的抑制效果以及選擇性都有顯著提高，尤其以苯乙基取代時，結(jié)果最優(yōu)。

其次保持R2、R4取代基為異丁基不變，改變R3取代基，獲得化合物8～10，發(fā)現(xiàn)將化合物1的R3取代基改為其他疏水性片段后，對酶抑制效果與選擇性都降低了，所以R3取代基仍舊保持為異丁基。

隨后再保持R2、R3取代基不變時，改變R4取代基的結(jié)構(gòu)，獲得化合物12～15，發(fā)現(xiàn)為芳香取代時，活性普遍較好，且以苯乙基取代時，選擇性與活性最優(yōu)。

基于以上結(jié)果，科研人員將R2、R3、R4的最優(yōu)基團結(jié)合在一起，得到了化合物16(YU－101) (見圖4)，以及其N－去乙?；苌?7?；钚詼y試顯示(見表3)，化合物17的活性、選擇性均較弱; 16的活性、選擇性更佳，其抑制蛋白酶體β5亞基的活性明顯強于Epoxomicin和Bortezomib等蛋白酶體抑制劑，并且在體內(nèi)具有強抗炎活性。

表3　化合物16、17對蛋白酶體不同亞基抑制活性

3.4候選化合物PR171的確定Crews將YU－101轉(zhuǎn)讓給了Proteolix制藥公司(后被Onyx收購)， Proteolix繼續(xù)進行改造得到了上百個化合物，但活性都不如YU－101。盡管YU－101抗腫瘤效果顯著，但Proteolix公司很快發(fā)現(xiàn)YU－101的水溶性差，難以成藥，因此引入嗎啉環(huán)，合成了活性保持而水溶性增加幾個數(shù)量級的化合物PR－171(見圖4)，并以此作為候選化合物進入臨床研究。

圖4　Carfizomib的優(yōu)化過程

4　Epoxomicin的上市

在Crews小組進行結(jié)構(gòu)改造的同時，硼酸二肽類藥物Bortezomib作為第一個蛋白酶體抑制劑成功上市，用于治療多發(fā)性骨髓瘤。但臨床研究發(fā)現(xiàn)Bortezomib不僅會出現(xiàn)血小板減少、周圍神經(jīng)炎等副作用，而且易產(chǎn)生耐藥，分析可能是由于其脫靶作用造成的［10］。而環(huán)氧酮肽類化合物Carfilzomib因其特殊的共價結(jié)合方式對蛋白酶體的選擇性高、結(jié)合力強，與Bortezomib相比能克服其脫靶作用，毒副反應較小。

對Carfilzomib的臨床前研究［11，12］也證實其對蛋白酶體以及免疫蛋白酶體β5亞基的抑制活性與Bortezomib相當，并且對其他的蛋白酶都沒有抑制活性;同時對Bortezomib耐藥的病人也十分有效。因此，Carfilzomib作為第二代蛋白酶體抑制劑被FDA批準上市，用于此前至少經(jīng)過兩個優(yōu)先療法，包括Bortezomib和免疫調(diào)節(jié)劑治療的多發(fā)性骨髓瘤患者。

5　總結(jié)

Carfilzomib從具有抗癌活性的天然產(chǎn)物Epoxomicin的發(fā)現(xiàn)，到其抑制蛋白酶體活性作用機制的闡明，再到通過結(jié)構(gòu)改造發(fā)現(xiàn)活性更強化合物YU－101，最終到水溶性更好的Carfilzomib上市，這一研發(fā)歷程對我們啟示頗多。

5.1生物界的次生代謝產(chǎn)物是為了自身的生長和種群的繁衍而產(chǎn)生的，生來不是為了給人類治病，毒性、成藥性等方面的缺陷決定了需要對它們進行結(jié)構(gòu)改造。面對作用機制不明，類藥性差等問題，應根據(jù)所研究的天然產(chǎn)物的性質(zhì)，進行個性化、量體裁衣式地改造，有針對性地優(yōu)化藥效、藥代、安全性等性質(zhì)。

5.2明確作用機制有利于進一步的修飾改造。Epoxomicin獨特的兩步形成共價結(jié)合的機制的闡明，不僅明確了作用靶標為蛋白酶體，同時提示了環(huán)氧酮基團的必要性，為接下來的改造工作提供了便利。

5.3研發(fā)的新藥必須要比上市或準上市藥物更具有優(yōu)勢。在Epoxomicin的改造過程中，首個蛋白酶體抑制劑Bortezomib進入臨床并批準上市，這對其他蛋白酶體抑制劑的開發(fā)也帶來了更大的挑戰(zhàn)和壓力。但Bortezomib由于其可逆結(jié)合的機制，毒副作用較大且易耐藥;而Epoxomicin作用機制獨特:它選擇性不可逆抑制蛋白酶體，以其為基礎研發(fā)的第二代蛋白酶體抑制劑Carfilzomib克服了Bortezomib毒副作用大的缺點，同時對Bortezomib耐藥的病人也有效果，故而得以在Bortezomib之后上市。

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·制劑研究·

·實驗研究·

專家簡介

胡立宏，男，中國科學院上海藥物研究所研究員、研究組長、博士生導師，研究工作主要涉及“基于中草藥資源的藥物發(fā)現(xiàn)”研究領域?，F(xiàn)任世界中醫(yī)藥學會聯(lián)合會中藥分析專業(yè)委員會理事、中國植物學會民族植物學分會理事、上海市藥學會天然藥化專業(yè)委員會委員、上海市口腔醫(yī)學重點實驗室學術(shù)委員會委員，以通訊作者身份在Journal of Neuroscience，Chemistry＆Biology，Journal of Medicinal Chemistry，Diabetes，Green Chemistry，Organic Letters等國際主流刊物上發(fā)表研究論文190余篇，獲得發(fā)明專利授權(quán)10余項。2009年以“天然藥物化學”研究方向獲得“國家杰出青年基金”資助，并入選“中國科學院百人計劃”，2012年獲得了“上海市優(yōu)秀學科帶頭人”稱號。

Carfilzomib: from natural product to drug

NIU Jun-xing，XU Xing-yu，HU Li-hong
(Shanghai Research Center for Modernization of Traditional Chinese Medicine，Shanghai Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201203，China)

Abstract:Natural products and their derivatives have been invaluable as a source of therapeutic agents.Carfilzomib，a potential chemotherapy drug for patients with multiple myeloma，was developed from a microbial natural product Epoxomicin.Epoxomicin was found to exhibit potent anti－cancer activity，which might attribute to its inhibitory activity against proteasome.Because of its unique two －step binding mode，Epoxomicin has a clear advantage compared to other proteasome inhibitors with their substantial off－target activity.With a more pontecy and better drug－like properties，Carfilzomib was developed from the lead compound Epoxomicin and approved by FDA as a second－generation proteasome inhibitor in 2012.

Key words:Proteasome inhibitor; Carfilzomib; Epoxomicin

基金項目:國家自然科學基金面上項目(No.81473110)

中圖分類號:R979.1

文獻標識碼:A

文章編號:2095－5375(2015) 10－0559－006