張　婷,劉文俊

(武漢市漢口醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科 b.病理科,武漢 430012)

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ASAP1蛋白在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義

張婷a※,劉文俊b

(武漢市漢口醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科 b.病理科,武漢 430012)

摘要：目的檢測(cè)乳腺癌組織中ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ASAP1)蛋白的表達(dá),探討ASAP1與乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性,為乳腺癌的防治尋找新的靶點(diǎn)。方法采用單純隨機(jī)抽樣選取2008年6月至2012年6月武漢市漢口醫(yī)院就診乳腺癌患者41例，進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)并分析乳腺癌組織中增殖細(xì)胞相關(guān)核抗原Ki67、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和人表皮生長因子受體2(HER2)的表達(dá)與ASAP1的相關(guān)性；比較不同轉(zhuǎn)移能力乳腺癌細(xì)胞株中ASAP1與HER2水平；檢測(cè)RNA干擾抑制ASAP1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)表達(dá)的影響，對(duì)照組MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入陰性對(duì)照干擾小RNA。結(jié)果免疫組織化學(xué)顯示乳腺癌組織中HER-2的表達(dá)與ASAP1無相關(guān)性(P=0.803),Ki67和MMP-2的表達(dá)與ASAP1有顯著相關(guān)性(P=0.035;P=0.013)；免疫印跡顯示高侵襲力乳腺癌細(xì)胞中ASAP1高表達(dá),低侵襲力乳腺癌細(xì)胞ASAPI呈弱表達(dá)(P<0.01)，HER-2的表達(dá)與ASAP1無相關(guān)性(P>0.05)；RNA干擾抑制MDA-MB-231細(xì)胞中ASAP1的表達(dá),VEGF水平顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論乳腺癌組織中ASAP1的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性,ASAP1有望成為乳腺癌的治療靶點(diǎn) 。

關(guān)鍵詞:乳腺癌；ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1； 增殖細(xì)胞相關(guān)核抗原Ki67；基質(zhì)金屬蛋白酶2；人表皮生長因子受體2

腫瘤的形成是一個(gè)多步驟、多階段的復(fù)雜過程,在此過程中, 增殖細(xì)胞相關(guān)核抗原Ki67(proliferating antigen Ki67)、基 質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和療效預(yù)后相關(guān)[1-4],ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ArfGAP with SH3 domain,ankyrin repeat and PH domain 1,ASAP1)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類腫瘤相關(guān)蛋白,其在乳腺癌中的臨床價(jià)值有待深入研究。本研究通過分析乳腺癌組織中ASAP1與Ki67、MMP-2、HER2表達(dá)的相關(guān)性,并在乳腺癌細(xì)胞系中觀察ASAP1表達(dá)與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的相關(guān)性及對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)的影響,為乳腺癌的防治研究提供線索。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源41例乳腺癌標(biāo)本取自2008年6月至2012年6月武漢市漢口醫(yī)院收治的原發(fā)性乳腺癌患者手術(shù)切除組織。患者均為女性,年齡31～67歲,平均(48±8)歲,術(shù)前未做化療和放射治療。

1.2細(xì)胞株乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、SKBR3及MCF-7購自武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心。

1.3主要試劑和儀器免疫組織化學(xué)一抗ASAP1(ab12423,產(chǎn)品批號(hào)：Ab100114001)、Ki67(RB-9043,產(chǎn)品批號(hào)：091215405F)、MMP-2(MAB-0244,產(chǎn)品批號(hào)：100124307A)及HER-2(RAB-0156,產(chǎn)品批號(hào)：091120204K)分別購自英國abcam 公司和福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。二抗購自Pierce公司(產(chǎn)品批號(hào)：100507299)。ASAP1 干擾小RNA(small interfering RNA，siRNA)(sc-41695,產(chǎn)品批號(hào)：sc-100102695)購自美國Santa Cruz公司,VEGF檢測(cè)試劑盒購自晶美公司(產(chǎn)品批號(hào)：090920204c)。HH.CP-01型二氧化碳培養(yǎng)箱購自中國上海博訊公司，165-8001型垂直電泳槽購自美國BIO-RAD公司； HC-2518R高速冷凍離心機(jī)購自安徽科大創(chuàng)新公司(離心半徑 6 cm)；BSG-4型生物安全柜購自中國珠海再鑫公司。

1.4方法

1.4.1免疫組織化學(xué)標(biāo)本均由10%中性甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋、切片和染色,一抗稀釋度(1∶500)。首先觀察其病理形態(tài)學(xué)改變,然后應(yīng)用免疫組織化學(xué)(SP法)檢測(cè)Ki67、MMP-2和HER2的表達(dá)與ASAP1在41例乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。另取癌旁非腫瘤的正常組織石蠟標(biāo)本為對(duì)照。陽性結(jié)果判斷：著色部位棕黃色顆粒為陽性,并以陽性細(xì)胞比率為主，記為-(不著色)、+(0～25%)、++(25%～50%)、+++(>50%),其中-～+為低表達(dá),++～+++為高表達(dá)。

1.4.2Western blot分別離心收集對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231、SKBR3及MCF-7細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液洗滌,蛋白提取緩沖液充分裂解,4 ℃,15 000 r/min離心10 min,收集上清。蛋白定量后,10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。分別加一抗Ki67、MMP-2和HER2的表達(dá)與ASAP1；二抗；電化學(xué)發(fā)光法系統(tǒng)顯影。

1.4.3siRNA檢測(cè)用Lipofectmine2000試劑轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA,ASAP1 siRNA至MDA-MB-231細(xì)胞,48 h后離心收集細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液洗滌。部分細(xì)胞用Trizol試劑提取RNA進(jìn)行半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)和1.5%瓊脂糖凝膠電泳,其余細(xì)胞用蛋白提取緩沖液裂解,離心收集上清,進(jìn)行后續(xù)的蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。

1.4.4VEGF檢測(cè)收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清,3000 r/min,離心20 min,采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè),具體操作見試劑盒說明書,檢測(cè)重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1乳腺癌組織中ASAP1表達(dá)與Ki67、MMP-2和HER2的相關(guān)性免疫組織化學(xué)顯示，ASAP1主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)或膜表面中,正常組織為陰性或低表達(dá),乳腺癌組織可呈陽性或強(qiáng)陽性(圖1),41例乳腺癌患者癌基因HER2表達(dá)與ASAP1表達(dá)水平無相關(guān)性(P=0.803)；而Ki67表達(dá)與ASAP1表達(dá)水平顯著相關(guān),其中20例Ki67高表達(dá)標(biāo)本中有15例ASAP1高表達(dá),21例Ki67低表達(dá)標(biāo)本中有8例ASAP1高表達(dá)(P=0.035)； MMP-2高表達(dá)與ASAP1表達(dá)水平顯著相關(guān)(P=0.013),其中21例MMP-2高表達(dá)標(biāo)本中有17例ASAP1高表達(dá),20例MMP-2低表達(dá)標(biāo)本中有8例ASAP1高表達(dá)。 見表1。

圖1乳腺癌組織中ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ASAP1)的表達(dá)(二氨基聯(lián)苯胺染色×200)1A：ASAP1(+++)；1B：ASAP1(++)；1C：ASAP1(+)；1D：ASAP1(-)

2.2ASAP1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲性的影響免疫印跡檢測(cè)顯示ASAP1表達(dá)水平高侵襲力乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中為(0.76±0.09)，低侵襲力乳腺癌細(xì)胞SKRB3表達(dá)水平為(0.37±0.07),MCF-7表達(dá)水平為(0.31±0.05),高侵襲力乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231表達(dá)水平顯著高于低侵襲力乳腺癌細(xì)胞SKRB3和MCF-7(F=35.180，P<0.01)；而HER2在三種細(xì)胞的表達(dá)依次為(0.33±0.05)、(0.67±0.11)和(0.23±0.07)，ASAP1的表達(dá)與HER2無顯著相關(guān)性(r=0.20，P=0.599)(圖2)。

2.3siRNA抑制ASAP1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞ASAP1蛋白表達(dá)的影響干擾組ASAP1的基因相對(duì)表達(dá)水平為(0.37±0.13)，對(duì)照組ASAP1的基因相對(duì)表達(dá)水平(0.72±0.21)，干擾組ASAP1的基因相對(duì)表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(t=-6.060,P=0.020); 干擾組ASAP1蛋白相對(duì)表達(dá)水平(0.33±0.07)，對(duì)照組ASAP1蛋白相對(duì)表達(dá)水平為(0.63±0.11)，干擾組ASAP1蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(t=12.990,P=0.010)(圖3)。

2.4RNA干擾抑制ASAP1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞 VEGF表達(dá)的影響ASAP1被抑制后,MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)上清液中干擾組VEGF為(59±21 ) μg/L，顯著低于對(duì)照組[(182±35) μg/L](t=56.90,P<0.05)。

3討論

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特征,在此過程中,腫瘤細(xì)胞需要穿越組織屏障,才能向周圍侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)MMP-2具有降解細(xì)胞外基質(zhì)和基膜的功能,MMP-2高表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)[1-2],而腫瘤的轉(zhuǎn)移往往伴隨著細(xì)胞的活躍增殖,目前公認(rèn)的反映腫瘤細(xì)胞增殖力的指標(biāo)是Ki67抗原,Ki67是一種存在于增殖細(xì)胞中的細(xì)胞核抗原,其表達(dá)水平與腫瘤增殖的活躍程度及預(yù)后呈正相關(guān)[3]。我國每年新診斷為乳腺癌的患者已增至近17萬人,盡管Herceptin針對(duì)HER2過度表達(dá)乳腺癌的靶向治療已取得明顯療效,但由于高額的治療費(fèi)用和耐藥性的發(fā)生[5],每年死亡人數(shù)仍近4萬人,因此乳腺癌的療效和預(yù)后的研究顯得尤為重要。近年來先后在卵巢癌、前列腺癌及胃癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)一類新的反映腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的蛋白ASAP1,它是Arf-GTP酶的受體,參與細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)和骨架蛋白的重構(gòu)[6-8],ASAP1與乳腺癌相關(guān)性的研究國內(nèi)目前少有報(bào)道,本研究在臨床乳腺癌病理組織中對(duì)HER2、Ki67及MMP-2與ASAP1表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示ASAP1不僅與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān),而且還是細(xì)胞增殖的指標(biāo),值得關(guān)注的是在乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)ASAP1的表達(dá)與乳腺癌基因HER2的表達(dá)無相關(guān)性，這一現(xiàn)象國內(nèi)外文獻(xiàn)均少見報(bào)道,推測(cè)HER2與ASAP1的表達(dá)缺乏共同的信號(hào)調(diào)控通路,說明HER2與ASAP1均高表達(dá)的乳腺癌在治療上將更加困難,因?yàn)橥活愃幬锟赡軣o法同時(shí)抑制HER2與ASAP1的表達(dá)；由于已經(jīng)報(bào)道的ASAP1的主要功能是參與腫瘤的轉(zhuǎn)移,為了進(jìn)一步驗(yàn)證其作用,本研究采用RNA干擾抑制高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中ASAP1的表達(dá)時(shí),檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的VEGF水平顯著降低,進(jìn)一步證明了ASAP1在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。

表1　乳腺癌組織中HER2和Ki67及MMP-2 與

HER2：人表皮生長因子受體2；Ki67：增殖細(xì)胞相關(guān)核抗原；MMP-2：基質(zhì)金屬蛋白酶2； ASAP1：ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1

圖2不同轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ASAP1)和人表皮生長因子受體2(HER2)的表達(dá)

圖3ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ASAP1)基因(左)和蛋白(右)水平檢測(cè)RNA干擾ASAP1-mRNA對(duì)ASAP1表達(dá)的影響

綜上所述,本研究在乳腺癌組織和細(xì)胞水平分別驗(yàn)證了ASAP1與腫瘤的轉(zhuǎn)移和增殖有相關(guān)性,提示ASAP1有望成為一類新的乳腺癌的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn),但值得注意的是HER2與ASAP1的表達(dá)卻無相關(guān)性,這可能與調(diào)控HER2表達(dá)和功能信號(hào)通路的復(fù)雜性和多樣性有關(guān)[9-12],說明病理診斷中聯(lián)合檢測(cè)HER2和ASAP1對(duì)乳腺癌的診斷、療效和預(yù)后有重要參考價(jià)值,HER2在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用與ASAP1是否存在共同機(jī)制尚不清楚,目前的研究發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白參與腫瘤轉(zhuǎn)移均與small GTPases家族相關(guān)[13-14],因此深入研究small GTPases在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用,有可能發(fā)現(xiàn)調(diào)控HER2與ASAP1的共同靶點(diǎn),將為乳腺癌的治療提供新的途徑。

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e23359.

Study on the Expression of ASAP1 in Breast Cancers and Its Clinical SignificanceZHANGTinga,LIUWen-junb. (a.DepartmentofLaboratoryMedicine,b.DepartmentofPathology,HankouHospitalofWuhan,Wuhan430012,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of ADP ribosyl-factor GTP enzyme activator protein 1(ASAP1) in breast cancer,and explore the correlation between ASAP1 and breast cancer,in order to find new target in the treatment for breast cancer.MethodsA total of 41 patients with breast cancer admitted in Hankou Hospital from Jun.2010 to Jun.2013 were selected by simple random sampling,the expression levels of proliferating cell nuclear antigen(Ki67),matrix metalloproteinases-2(MMP-2),human epidermal receptor 2(HER2) and ASAP1 in breast cancer were detected by immunohistochemistry method in order to explore the correlation;the expression levels of HER2 and ASAP1 in mammary cancer cells with different invasiveness was detected by Western blot and compared;furthermore,the impact of siRNA on vascular endothelial growth factor (VEGF) expression was investigated，negative siRNA was added into the MDA-MB-231 cell culture system.Resluts Statistical analysss showed that HER2 expression had no correlation with ASAP1(P=0.803),and was significantly associated with Ki67 and MMP-2(P=0.035;P=0.013)；immunobloting assay demostrated that highly invasive breast cancer cells with a high level of ASAP1 and low unes with a weak ASAP1 expression (P<0.01),in contrast,no association between HER2 and ASAP1 was observed (P>0.05);expression of ASAP1 in MDA-MB-231 cells was repressed by siRNA,while expression level of VEGF was significantly lower than the control group(P<0.01).ConclusionExpressionofASAP1inbreastcanceriscorrelatedwiththeproliferationandmetastasisofthecancercells,therefore,ASAP1canbeatherapeutictargetinthetreatmentforbreastcancer.

Keywords：Breastcancer;ADPribosyl-factorGTPenzymeactivatorprotein1；ProliferatingcellnuclearantigenKi67；Matrixmetalloproteinase-2；Humanepidermalreceptor2

收稿日期：2014-04-24修回日期：2014-12-17編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.11.051

中圖分類號(hào)：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)11-2057-03