吳慶建，閆承軍，宋大慶，劉云海，孫樹印

(濟寧市第一人民醫(yī)院急診內(nèi)科，山東 濟寧 272011)

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降鈣素基因相關肽經(jīng)鼻給藥對大鼠腦梗死的預防和保護作用

吳慶建，閆承軍，宋大慶，劉云海，孫樹印※

(濟寧市第一人民醫(yī)院急診內(nèi)科，山東 濟寧 272011)

摘要：目的探討降鈣素基因相關肽(CGRP)經(jīng)鼻給藥對大鼠局灶性腦梗死的保護能力，為腦梗死的治療提供新思路。方法30只健康8周齡SD大鼠隨機分為正常對照組、局灶性腦梗死組和實驗組，各10只。采用線栓法制作大鼠大腦中動脈閉塞腦缺血/再灌流模型；測定腦組織水、Na+含量；采用神經(jīng)病理學評分標準進行神經(jīng)功能評價；用TTC染色法觀察鼠腦梗死部位和計算梗死體積。結果實驗組腦組織含水量和Na+含量顯著低于局灶性腦梗死組[(80.2±1.3)%比(85.4±1.3)%；(458±47) μmol/g比(590±39) μmol/g]，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。實驗組腦梗死體積和神經(jīng)功能評分顯著低于局灶性腦梗死組[(16.4±1.3)%比(43.4±5.1)%；(7.0±0.5)分比(26.7±4.2)分]，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 結論CGRP經(jīng)鼻給藥對大鼠局灶性腦梗死有預防和保護作用，對減輕腦水腫有良好的作用。

關鍵詞：腦梗死；降鈣素基因相關肽；腦水腫；經(jīng)鼻給藥

腦梗死由于其高致殘率嚴重危害人類健康，腦水腫是腦梗死的嚴重并發(fā)癥之一，是導致神經(jīng)功能障礙的主要病理生理改變，嚴重威脅患者的生命[1]。降鈣素基因相關肽(calcitonin generelated peptide，CGRP)是第一個利用基因重組技術發(fā)現(xiàn)的由37個氨基酸組成的活性多肽，是目前發(fā)現(xiàn)最強的血管擴張劑[2]，廣泛存在于神經(jīng)組織，具有改善腦血流和保護神經(jīng)的作用[3]。由于其相對分子質(zhì)量較大，半衰期短，經(jīng)靜脈給藥很難透過血腦屏障到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本研究在大鼠實驗性腦梗死模型上經(jīng)鼻靶向中樞導入CGRP，通過觀察神經(jīng)系統(tǒng)評分、梗死體積、腦組織含水量等指標變化，探討經(jīng)鼻預防給予CGRP對實驗性腦梗死后腦水腫和腦損傷的預防和保護作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物和分組8周齡健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠(購于濟寧市魯抗動物實驗中心)，30只，SPF級，雌雄各15只，體質(zhì)量200～240 g。經(jīng)山東省動物檢疫所檢驗合格，許可證號：SCCK(魯)2013-0023。動物反應良好，無脫毛、斷尾。30只大鼠隨機分為3組，各10只。正常對照組：雌雄各5只，體質(zhì)量為(218±4) g，不經(jīng)任何處理；局灶性腦梗死組：雌雄各5只，體質(zhì)量(220±5) g，經(jīng)線栓法制作腦梗死模型，苦味酸(黃色)標記；實驗組：雌雄各5只，體質(zhì)量(217±6) g，預防給藥，于模型制作成功后立即經(jīng)鼻給藥，品紅(紅色)標記。3組大鼠的性別、體質(zhì)量等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2試劑和儀器CGRP：購自SIGMA，USA，批號：201211029。其余均為國產(chǎn)分析純試劑，包括水合氯醛、75%酒精、甲醇、鄰苯二甲醛、3-甲基組氨酸、多聚甲醛，均購自天津化學試劑三廠。紗布、尼龍線購自臨沂市達三江好纖線業(yè)公司。體溫計購自上海華辰醫(yī)用儀表有限公司。微量注射器由香港友誠生物科技有限公司提供。

BL-620S電子天平購自日本島津公司。電烤箱由東莞畢星機械有限公司提供。M3100型原子吸收分光光度計購自美國PE公司。

1.2方法

1.2.1動物模型的制作參照Zea-longa的線栓法[4]，大鼠經(jīng)水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，仰臥位固定于手術臺上，75%的酒精消毒頸部皮膚，在手術顯微鏡下取頸正中切口，分離出右側頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，將頂端圓鈍的4-0尼龍線從頸外動脈插入頸內(nèi)動脈從而阻斷大腦中動脈起始端。插入的尼龍線長度為(18.5±0.5) mm。大鼠大腦中動脈閉塞60 min后，將尼龍線緩慢退出至頸總動脈予以再灌注。在手術過程中，持續(xù)監(jiān)測SD大鼠體溫，通過肛表電熱毯反饋裝置將SD大鼠體溫維持在37 ℃。

1.2.2給藥方法麻醉大鼠后取仰臥位固定，頭頸部用紗布墊高，以有利于藥物進入后鼻腔。各組均于再灌流后，經(jīng)鼻腔插入一根與微量注射器相連的5.0 cm長的PE-50號硅膠管，分別給予CGRP 1 μg (溶于50 μL媒介液中)，兩側鼻孔交替給藥，當一側鼻孔給藥時，將大鼠的嘴及另一側鼻孔封閉。每單次給藥量為5 μL，間隔時間2 min，每只大鼠給予10次，20 min 內(nèi)給予總量為50 μL的藥液。

1.2.3腦組織水、Na+含量測定局灶腦梗死組和實驗組均于模型建立后24 h快速斷頭處死大鼠后取出腦組織，用濾紙吸去表面鮮血，稱濕重并記錄后將腦組織置于烤箱中烘干，稱出干重并記錄，稱重天平為 1/1000 g電子分析天平。腦組織含水量計算公式：(濕重-干重)/濕重×100%。采取原子吸收法計算Na+含量，在原子吸收分光光度計上直接測定，波長為589 nm。使用EDS軟件處理數(shù)據(jù)，結果由計算機打印，單位為 μmol/g(干重腦組織)。

1.2.4腦梗死體積的測定將大鼠腦在冰浴上取出，-20 ℃凍存30 min，切成2 mm厚的連續(xù)切片。TTC常規(guī)染色，4%多聚甲醛固定，將TTC染色片掃描至計算機中，計算總的梗死體積及左右半球體積。為糾正腦水腫對梗死體積的影響，采用以下公式：梗死體積(%)=[左半球體積-(右半球體積-梗死體積)]/左半球體積×100%計算梗死體積。

1.2.5神經(jīng)功能評分參照神經(jīng)病理學評分標準[1]分別對每只動物用前肢放置實驗、后肢放置實驗和平衡木實驗進行行為神經(jīng)功能評分。

2結果

2.1CGRP對大鼠局灶性腦梗死后腦組織水、Na+含量的影響各組大鼠腦組織水含量、Na+含量比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其中局灶性腦梗死組腦組織水含量、Na+含量高于正常對照組(P<0.01)，但實驗組腦組織水含量、Na+含量低于局灶性腦梗死組(P<0.01)，見表1。

表1　CGRP對大鼠局灶性腦梗死后

a與正常對照組比較，P<0.01；b與局灶性腦梗死組比較，P<0.01

2.2CGRP對局灶性腦梗死體積和神經(jīng)功能評分的影響各組大鼠梗死體積和神經(jīng)功能評分比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其中局灶性腦梗死組腦梗死體積和神經(jīng)功能評分顯著高于正常對照組(P<0.01)，但實驗組腦梗死體積和神經(jīng)功能評分顯著低于局灶性腦梗死組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

表2　CGRP對局灶性腦梗死體積和

a與正常對照組比較，P<0.01；b與局灶性腦梗死組比較，P<0.01

3討論

近十多年的研究已經(jīng)證實，很多藥物經(jīng)鼻給藥后能繞過血腦屏障進入腦脊液或腦組織而發(fā)揮治療作用。經(jīng)鼻給藥具有無創(chuàng)、簡便、靶向性強等優(yōu)點，是一種全新的中樞神經(jīng)系統(tǒng)給藥途徑。CGRP是由37個氨基酸殘基組成的神經(jīng)肽，廣泛分布于周圍神經(jīng)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，參與多種疾病的病理過程，是受到神經(jīng)病學研究者高度重視的神經(jīng)活性物質(zhì)[5]，與心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關[6]。但由于血腦屏障的存在，加之CGRP大分子特性，外源性的CGRP給藥難以到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮有效的血藥濃度。研究表明，腦池內(nèi)應用CGRP能逆轉兔實驗性腦血管痙攣[7]。有研究針對大鼠全腦缺血/再灌注模型采用經(jīng)頸動脈注入CGRP的方法研究CGRP對腦組織神經(jīng)細胞缺血性損傷的影響，腦組織切片染色發(fā)現(xiàn)CGRP對缺血后海馬CA1的錐體細胞起到了保護作用[8]。腦內(nèi)直接注射、經(jīng)頸動脈注入作為侵入性操作，不可能成為常規(guī)的給藥途徑。劉新峰等[9]研究發(fā)現(xiàn),胰島素樣生長因子經(jīng)鼻給藥可進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)并有效治療實驗性腦梗死。

經(jīng)鼻給予CGRP對局灶性腦梗死所致腦水腫有顯著的預防作用。Liu等[10]通過研究小鼠腦梗死模型認為，CGRP能減少動脈灌注壓,梗死體積,腦水腫,血腦屏障通透性,水通道蛋白4 mRNA和水通道4蛋白表達。此外,CGRP還可改善毛細血管內(nèi)皮細胞超微結構損傷，減少緊密連接后的損失,再灌注46 h后采用透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)CGRP能顯著減少腦水腫。本研究結果顯示，實驗組大鼠腦組織含水量和Na+含量低于局灶性腦梗死組(P<0.01)，與Liu等[10]的研究結果一致。此外，CGRP還能延緩腦梗死對胃黏膜的破壞作用。Feng等[11]研究了30例健康成年雄性小鼠，分為CGRP治療組和對照組。結果顯示，CGRP能調(diào)節(jié)胃泌素、生長抑素、水通道蛋白4和成纖維細胞生長因子的分泌,肥大細胞退化，從而減輕腦梗死對胃黏膜的破壞。

經(jīng)鼻給予CGRP對局灶性腦梗死具有顯著的預防作用。Holland等[12]研究靜脈內(nèi)灌注CGRP[100 ng/(kg·m)] 5 h后認為，腦梗死小鼠腦部血流和腦損傷體積明顯好轉。實驗組缺血性腦血流為(32±2) mL/(100 g·min)，對照組為(13±2) mL/(100 g·min)(t=6.92,P<0.01)；實驗組缺血性腦損傷容積 為(102±22) mm3，對照組為(234±19) mm3(t=4.47,P<0.01)，從而延緩了局灶性腦梗死。本研究結果顯示，實驗組腦梗死體積和神經(jīng)功能評分顯著低于局灶性腦梗死組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，也從另一個角度驗證了Holland等[12]的研究結果。內(nèi)皮素是迄今已知作用較強的縮血管因子，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其縮血管和促血管平滑肌細胞增生的作用強大，與CGRP有強烈持久的拮抗效應[13]。缺血缺氧、缺血/再灌注損傷都可以促進內(nèi)皮素大量釋放，其強烈縮血管作用導致缺血缺氧加重。研究表明[13]，腦梗死的病理生理過程與內(nèi)皮素和CGRP比例失衡有關，直接作用于神經(jīng)細胞，導致細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，神經(jīng)元功能發(fā)生不可逆的損傷。CGRP具有有拮抗內(nèi)皮素的作用，對腦血流的調(diào)節(jié)起關鍵作用[14]，可以減少炎性滲出、抑制炎性介質(zhì)的微血管反應[15]，從而發(fā)揮腦保護作用。為拮抗腦梗死后內(nèi)皮素的縮血管效應，內(nèi)源性CGRP被耗損，若中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷區(qū)獲得較高濃度的外源性CGRP，可大大提高腦保護作用[16]。

本研究結果表明，經(jīng)鼻靶向中樞給予CGRP可以有效降低腦梗死大鼠腦組織含水量、Na+含量，減輕腦梗死后腦水腫。局灶性腦梗死組和實驗組大鼠行為神經(jīng)評分顯著優(yōu)于正常對照組，但實驗組上述指標均低于局灶性腦梗死組(P<0.01)。

綜上所述，經(jīng)鼻經(jīng)鼻靶向中樞給予CGRP可有效避開血腦屏障，進入腦損傷區(qū)發(fā)揮神經(jīng)保護作用，顯示出對腦梗死的確切治療效果，說明對大鼠局灶性腦梗死有預防和保護作用。但其具體機制仍待進一步研究。

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Preventive and Protective Effect of Intranasal Delivery of Calcitonin Generelated Peptide on Cerebral Infarction in RatsWUQing-jian，YANCheng-jun，SONGDa-qing，LIUYun-hai，SUNShu-yin.(DepartmentofEmergencyMedicine,JiningFirstPeople′sHospital，Jining272011，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the protective effect of intranasal administration of calcitonin gene related peptide(CGRP) effects on focal cerebral infarction in rats,in order to provide a new way of treatment for cerebral infarction.MethodsA total of 30 healthy SD rats aged 8 weeks were randomly divided into the normal control group,the focal cerebral infarction group,and the experimental group,with 10 rats in each group.The middle cerebral artery occlusion(MCAO)/reperfusion model of the rats was made by nylon strand.Contents of water and sodium in the brain were detected.The neurological function was evaluated according to neuropathological criteria.The volume of cerebral infarction and its location were determined by TTC staining.ResultsContents of water and Na+in brains of the experimental group were significantly lower than those of of the focal cerebral infarction group [(80.2±1.3)% vs (85.4±1.3)%；(458±47) μmol/g vs (590±39) μmol/g],the differences were statistically significant(P<0.01).The volume of cerebral infarction and neurological score of the experimental group were significantly lower than those of the focal cerebral infarction group [(16.4±1.3)% vs (43.4±5.1)%；(7.0±0.5) scores vs (26.7±4.2) scores], the differences were statistically significant(P<0.01).ConclusionIntranasal administration of CGRP has definite preventive and protective effect on focal cerebral infarction in rats.It also has good effects of inhibition of brain edema.

Key words:Cerebral infarction; Calcitonin generelated peptide; Cerebral edema; Intranasal administration

收稿日期：2014-11-10修回日期：2015-03-04編輯：伊姍

基金項目：2010年濟寧市科技局立項課題(濟科字〔2010〕85號-24)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.11.054

中圖分類號：R361.2

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)11-2064-03