張安星，張 晗，陽(yáng) 琰，高 琳，廖 鑫，楊孟雪

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴州遵義563000）

糖尿病是全球普遍關(guān)注的嚴(yán)重影響人類健康的疾病，體內(nèi)多種因素與糖尿病、肥胖、胰島素抵抗這些病理狀態(tài)相關(guān)，但目前糖尿病發(fā)生、發(fā)展的確切機(jī)制并不完全清楚。有研究顯示內(nèi)脂素（visfatin）具有類胰島素的作用，能調(diào)節(jié)血糖，在機(jī)體糖脂代謝中發(fā)揮重要作用［1］，但研究報(bào)道其在糖脂代謝及胰島素抵抗中的作用并不一致。本研究通過建立糖尿病及肥胖大鼠動(dòng)物模型，測(cè)定肝組織中visfatin、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的表達(dá)，探討visfatin與葡萄糖6磷酸酶（G-6-Pase）、AMPK 的關(guān)系，將可能為糖尿病及胰島素抵抗的防治提供理論依據(jù)。

表1 PCR 引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

表2 各組大鼠代謝指標(biāo)比較（±s）

表2 各組大鼠代謝指標(biāo)比較（±s）

-：此項(xiàng)無數(shù)據(jù)。

組別 n 體質(zhì)量（g） 內(nèi)脂質(zhì)量／體質(zhì)量（%）FBG（mmol／L）FFA（mmol／L）TG（mmol／L）TC（mmol／L）HOMA-IR ISI NC組 10 408.60±44.11 2.17±0.54 4.40±1.05 375.50±163.75 0.24±0.09 1.11±0.32 2.01±0.74 0.030 0±0.010 0 DIO組 12 619.00±29.55 4.29±1.05 5.11±0.57 479.42±151.71 1.13±0.48 1.59±0.41 5.61±2.23 0.010 0±0.005 0 DM 組 10 405.80±69.53 2.03±0.81 25.52±2.75 1 260.30±587.67 6.65±3.07 6.71±3.27 43.21±10.72 0.001 0±0.000 2 INS組 9 468.45±33.31 3.61±1.02 6.04±1.57 727.44±280.41 2.72±1.34 1.89±0.32 - -MET組 9 422.67±29.27 2.62±1.25 6.97±1.35 646.56±1 92.97 1.55±0.61 1.80±0.33 - -

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)雄性SD 大鼠70只，體質(zhì)量180～220g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物中心提供。高脂高糖飼料為在普通飼料中加20%的煉豬油、10%的蛋黃、5%的葡萄糖、2%的膽固醇。胰島素放免試劑盒（科美東雅公司），鏈脲佐菌素（STZ，sigma），Trizol Reagent、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、焦碳酸二乙酯（DEPC）、SYBR?GREEN PCR Master Mix；辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊、小鼠IgG、RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白濃度定量試劑盒、彩色預(yù)染marker、ECL 顯色試劑盒由碧云天生物有限公司提供；引物由寶生物公司合成，visfatin抗體由Biovision公司提供；AMPKα抗體、p-AMPKα抗體均由cell signaling 公司提供；β-actin抗體由中杉金橋公司提供；鹽酸二甲雙胍（施貴寶公司），胰島素注射液（萬邦公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 適應(yīng)性喂養(yǎng)SD大鼠1周后，分為正常對(duì)照組（NC組）10只、肥胖組（DIO 組）15只、糖尿病組（DM 組）15只、胰島素治療（INS組）15只、二甲雙胍治療組（MET 組）15只。NC組大鼠普通飼料喂養(yǎng)，其余大鼠用高脂高糖飼料喂養(yǎng)。DIO 組喂養(yǎng)12周，禁食12h后稱體質(zhì)量，大于NC組大鼠平均體質(zhì)量20%者為DIO 成模，共成模12 只。DM 組、INS組、MET 組大鼠經(jīng)喂養(yǎng)8周后禁食12h后稱質(zhì)量，按40mg／kg腹腔注射鏈脲佐菌素，1 周后測(cè)FPG，2 次FPG≥16.7 mmol／L為糖尿病大鼠成模，共成模10只。NC組、DIO組 腹腔注射0.1 mmol／L 檸檬酸緩沖液。INS組用低精蛋白鋅胰島素腹部皮下注射，使FPG＜11.1mmol／L，共有成模9只；二甲雙胍300mg·kg-1·d-1灌胃，控制FPG＜11.1 mmol／L，共計(jì)成模9只。至12周全部大鼠禁食12h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后腹主動(dòng)脈取血，血清測(cè)FFA、TG、TC、Fins。肝臟放入-80 ℃冰箱保存；另取同一部位小塊肝臟液氮速凍后移入-80 ℃冰箱凍存。

1.2.2 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 強(qiáng)生穩(wěn)步倍加型血糖儀及相應(yīng)配套試紙測(cè)定FBG，F(xiàn)FA、TG、TC 用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，放射免疫法檢測(cè)血清Fins。胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）＝FBG×Fins／22.5。胰島素敏感性指數(shù)（ISI）＝1／（Fins×FBG）。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)肝組織中visfatin、G-6-Pase mRNA 的表達(dá) 用美國(guó)BIO-RAD公司icycler熒光定量PCR 儀，按TaKa-Ra逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用15μL PCR反應(yīng)體系：iQ SYBR Green Supermix 7.5μL，模板混合液0.5μL，cDNA template 3μL，DEPC水4μL。反應(yīng)條件：95℃3min；95 ℃10s，退火溫度61.6 ℃30s，循環(huán)40次。取CT平均值。引物序列見表1。

1.2.4 Western blot測(cè)定visfatin、AMPKα、p-AMPKα的蛋白表達(dá) 肝臟組織PBS洗滌剪碎后加入RIPA 裂解液，震碎、裂解，離心后取上清液。BCA 法測(cè)定蛋白濃度。100 ℃、5 min蛋白變性后上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入visfatin／AMPKα／p-AMPKα一抗孵育過夜，次日加入二抗，孵育1h顯影，凝膠成像拍照并條帶掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，多組間采用方差分析，偏態(tài)分布經(jīng)秩次轉(zhuǎn)換。正態(tài)分布數(shù)據(jù)用Perason相關(guān)分析，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠代謝指標(biāo)比較 DIO 組、INS組內(nèi)脂質(zhì)量／體質(zhì)量較NC 組明顯升高，DM 組、MET 組內(nèi)脂質(zhì)量／體質(zhì)量較DIO 組顯著降低（P＜0.01），INS組內(nèi)脂質(zhì)量／體質(zhì)量較DM組顯著升高（P＜0.01），MET 組內(nèi)脂質(zhì)量／體質(zhì)量較INS組顯著下降（P＜0.05）。DM 組FBG 比NC 組、DIO 組顯著升高（P＜0.01）；INS 組、MET 組FBG 比DM 組 明 顯 降 低（P＜0.01）。DIO 組、DM 組HOMA-IR均較NC組明顯升高，而ISI均顯著降低（P＜0.01）；DM 組HOMA-IR 較DIO 組明顯升高，ISI明顯降低（P＜0.01）。DIO 組TG 較NC 組顯著升高（P＜0.01）；DM 組、INS組及MET 組TG、TC 均比NC 組 明顯升高（P＜0.05）；DM 組TG 比DIO 組明顯升高（P＜0.05）；MET 組、INS組TG 比DM 組明顯降低（P＜0.05）。DM 組、INS組、MET 組FFA 較NC 組顯著升高（P＜0.05）；DM 組FFA 較DIO 組顯著增高（P＜0.05），見表2。

2.2 各組大鼠肝組織visfatin、G-6-Pase mRNA 比較 DM 組visfatin mRNA 較NC組、DIO 組均顯著升高（P＜0.05），INS組、MET 組visfatin mRNA 均較DM 組顯著下降（P＜0.01）。DM 組、INS組、MET 組G-6-Pase mRNA 均 較DIO 組 顯 著 升高（P＜0.05），DIO 組G-6-Pase mRNA 均 較NC 組 顯 著 降 低（P＜0.01），MET 組G-6-Pase mRNA 較DM 組及INS組均顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠肝組織visfatin、G-6-Pase mRNA 表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠肝組織visfatin、G-6-Pase mRNA 表達(dá)比較（±s）

組別 n visfatin G-6-Pase NC組5 65.41±28.73 131.57±31.46 DIO 組 5 116.23±57.66 35.12±7.65 DM 組 5 220.03±96.62 159.37±39.92 INS組 5 40.32±10.52 194.50±59.87 MET 組5 36.05±16.51 108.40±26.23

2.3 各組大鼠肝組織visfatin、AMPKα、p-AMPKα蛋白表達(dá)比 較 DM 組、INS 組、MET 組visfatin蛋 白 表 達(dá) 均 較NC 組明顯升高（P＜0.05）；DM 組、INS組、MET 組AMPKα蛋白表達(dá)均較NC組顯著降低（P＜0.05），DM 組AMPKα的蛋白表達(dá)較DIO 組顯 著 降 低（P＜0.05）。DIO 組、DM 組、INS 組、MET 組p-AMPKα蛋白的表達(dá)較NC組顯著降低（P＜0.01），見表4、圖1。

表4 各組大鼠肝組織visfatin、AMPKα、 p-AMPKα蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠肝組織visfatin、AMPKα、 p-AMPKα蛋白表達(dá)比較（±s）

組別 n visfatin AMPKα p-AMPKα NC組5 0.38±0.18 1.19±0.22 0.83±0.08 DIO 組 5 0.60±0.22 0.94±0.14 0.43±0.03 DM 組 5 0.75±0.23 0.66±0.23 0.37±0.03 INS組 5 0.69±0.08 0.89±0.20 0.39±0.04 MET 組5 0.66±0.14 0.77±0.25 0.48±0.13

圖1 各組大鼠肝組織visfatin、AMPKα、p-AMPKα蛋白表達(dá)

2.4 visfatin 表達(dá)與G-6-Pase表達(dá)相關(guān)性分析 NC 組visfatin mRNA 與G-6-Pase mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)（r＝1.000，P＜0.01），INS 組visfatin 與G-6-Pase mRNA 表 達(dá) 呈 負(fù) 相 關(guān)（r＝-0.996，P＝0.004）

3 討 論

visfatin高表達(dá)于人及動(dòng)物的脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨骼肌、腎臟及心臟等部位，研究認(rèn)為其能夠調(diào)節(jié)胰島素分泌［1］，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于visfatin在肝臟中的表達(dá)研究結(jié)果并不一致。研究表明KKAy小鼠隨著糖尿病的發(fā)展，肝臟visfatin mRNA 的表達(dá)有逐漸增高趨勢(shì)［1］；高脂喂養(yǎng)大鼠visfatin mRNA 的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高［2］，也有研究認(rèn)為2型糖尿病患者肝臟visfatin mRNA 表達(dá)較糖耐量正常者降低［3］。在糖尿病小鼠模型中顯示短期激活肝臟AMPK 可使血糖降低［4］。研究發(fā)現(xiàn)，激活A(yù)MPK 可以降低肝糖代謝中兩種關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和G-6-Pase的表達(dá)［5］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AMPK的活性可受多種脂肪因子調(diào)節(jié)，而visfatin對(duì)AMPK 的調(diào)節(jié)作用尚不清楚，體外培養(yǎng)的大鼠脂肪細(xì)胞中，二十碳五烯酸能夠通過激活A(yù)MPK 通道而增加visfatin的表達(dá)與分泌［6］。研究發(fā)現(xiàn)visfatin可能下調(diào)AMPK 活性［2］，肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪visfatin蛋白表達(dá)和AMPK 的活化負(fù)相關(guān)。

本研究建立起具有胰島素抵抗與胰島素分泌障礙的糖尿病大鼠模型，INS組內(nèi)脂質(zhì)量較DM 組明顯增加，而MET 組則明顯低于INS組。DM 組、INS組、MET 組visfatin蛋白表達(dá)較NC組顯著升高，DM組visfatin mRNA表達(dá)量較NC組及DIO 組顯著升高，可能是血糖的升高導(dǎo)致組織代償性的分泌更多的visfatin，胰島素代謝通路被激活，而血糖降低對(duì)visfatin的表達(dá)起了負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，INS組、MET組visfatin mRNA 的表達(dá)均較DM 組顯著下降，與Chen等［4］的研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。AMPK 通道的激活被認(rèn)為是二甲雙胍發(fā)揮降糖作用的重要途徑，MET 組visfatin、AMPKα、p-AMPKα蛋白的表達(dá)與INS 組無顯著差異，visfatin 蛋白的表達(dá)與AMPKα、p-AMPKα蛋白的表達(dá)并無明顯相關(guān)性，提示二甲雙胍激活A(yù)MPK 降血糖的機(jī)制中并無visfatin的直接參與。

本實(shí)驗(yàn)中DM 組G-6-Pase mRNA 表達(dá)較DIO 組明顯升高，這與國(guó) 內(nèi)報(bào) 道 一 致［7］，而MET 組G-6-Pase mRNA 較DM組、INS組均顯明降低，NC 組中visfatin mRNA 與G-6-Pase mRNA 的表達(dá)呈正相關(guān)，其因果關(guān)系及機(jī)制有待于更進(jìn)一步的研究，G-6-Pase或許參與了生理狀態(tài)下visfatin調(diào)節(jié)機(jī)制。

綜上所述，糖尿病大鼠肝組織visfatin的表達(dá)明顯升高，可能與胰島素抵抗及糖尿病發(fā)生有關(guān)，visfatin可能激活了胰島素受體而發(fā)揮降糖作用，但visfatin在糖尿病及胰島素抵抗機(jī)制中具體作用如何，還有待于對(duì)其進(jìn)行更深入的研究。

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