陳慧慧 朱 煌 郭熙志

脊椎在整個(gè)軀干和頭部支撐中扮演著非常重要的角色，且可為脊髓提供保護(hù)作用，并在前后軸方向上展示出區(qū)域性形態(tài)特征［1］。脊椎發(fā)育可分為早、晚期階段，即前原節(jié)中胚層體節(jié)分割和脊椎特化［2］。前原節(jié)中胚層周期性分割信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、Wnt和 Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［2－3］，同時(shí)體節(jié)模式和形態(tài)變化也受Hox基因調(diào)控［4］。Hox基因由13個(gè)旁系同源基因線性排列組合而成，形成了體節(jié)特性的組合密碼［4－7］，其功能性缺失和功能獲得性突變通常導(dǎo)致椎體同源轉(zhuǎn)變?nèi)毕荩?，8］。

N－Myc下游調(diào)控基因家族（Ndrg1～4）屬于α／β水解酶家族，其具有高度保守性［9］。人類Ndrg基因家族成員氨基酸序列具有53%～65%的相似性［10－11］，但 Ndrg1和 Ndrg2蛋白因缺少水解酶催化位點(diǎn)而不具有水解酶催化活性［11］。研究報(bào)道，Ndrg1是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，涉及胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌和前列腺癌等發(fā)生［9，12－14］，而 Ndrg2 是 一 種 腫 瘤 抑 制基因［10－11］。我們的前期研究表明，Ndrg2是體節(jié)分化過程中的一種新型脊椎特化調(diào)控因子［3］，但Ndrg1基因在脊椎特化中的作用目前尚不清楚。本研究將重點(diǎn)分析Ndrg1－／－鼠的脊椎特性和結(jié)構(gòu)，觀察Ndrg1敲除對(duì)椎體同源轉(zhuǎn)換的作用并探討其發(fā)生機(jī)制，同時(shí)與Ndrg2在骨骼發(fā)育中的功能進(jìn)行對(duì)照研究。

1 資料與方法

1.1 研究材料

Ndrg1fl／fl制備：采用靶向載體電轉(zhuǎn)R1胚胎干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過程使用G418抗生素，篩選具有G418抗性的胚胎干細(xì)胞克隆，并通過Sourthern免疫印跡確定正確靶向克??；將經(jīng)篩選的胚胎干細(xì)胞注射到囊胚中獲得老鼠嵌合體，此即為 Ndrg1fl／fl鼠［3］。

將條件性敲除鼠與Actin－Cre鼠雜交以獲得Ndrg1－／－、Ndrg2－／－鼠。Ndrg1等位基因缺失鑒定引物 為 P1（5’－AGCAGGCTCTTAAAGCGGCTCC－3’）、P2（5’－CCGCCTCTGTCAAATTAGTAGCTG－3’）、P3（5’－GGGAGAGCTGAAGGCTGTTCTAGG－3’），Ndrg2等位基因缺失鑒定引物為 P4（5’AAAAGCTCTCCGTGTGTCTTGGCGT－3’）、P5（5’GTCATTTGGGAGAATGGAGGAGGCA－3’）。所有小鼠均為C57BL／6小鼠。實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵照上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理法規(guī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

RNA原位雜交：采用地高辛標(biāo)記的FGF－8基因探針［15－16］。自主合成 Ndrg1、Hoxc8、Hoxc11基因探針，Ndrg1、Hoxc8、Hoxc11 cNDA 模板引物分別為 （F）5’AGTCTACTAGGCTCACTTGAAG－GAA、（R）5’CACGGTAGGAGTTGGCAGGAA，（F）5’TCTTCACGGTGCTTCTCTGGTAT、（R）5’GGCTAGGCAGTCTCAGTTGTTG，（F）5’GGCCTGGAACCGTCCGGGAAGTG、（R）5’TT－GGTCGCCGAGTGGGAAGAACC。其余基因探針完全以 Hoxc9（BC050838）、Hoxc10（BC053405）cDNA克隆為模板。

實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT－PCR）：收集10.5 d的 Ndrg1－／－ 鼠胚胎及其同窩小鼠，10.5 d時(shí)應(yīng)用一步法從后面體節(jié)到第12塊體節(jié)抽提總RNA，采用qRT－PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)情況。Ndrg1 引 物 為 （F）5’GGTGAAGCCTCTGGTG－GAAAAAG、（R）5’GTGAGGATGACAGGACG－GTTGC，Hoxc8引物為（F）5’GTCCATGCCTTC－CTTGCCTTG、（R）5’ATGGTGACTTCTGAG－CACAAACA，Hoxc9 引 物 為 （F）5’TGTAG－CGATTTTCCGTCCTGTAG、（R）5’CCGTA－AGGGTGATAGACCACAGA，Hoxc10 引 物 為（F）5’GGGCCAAGACCGCAGACT、（R）5’GC－CAATTTCCTGTGGTGTTTTC，Hoxc11引物為（F）5’GCGGCCGACGAGCTTATG、（R）5’TTTTTCATGAGGATCTCAGTGACTGT?；蚪MDNA來源于野生型小鼠鼠尾。

骨架染色：出生后6 d的 Ndrg1－／－和Ndrg1／2－／－鼠窒息處死后，去除皮膚、內(nèi)臟及結(jié)締組織，進(jìn)行阿爾新藍(lán)和茜素紅染色［17］。

2 結(jié)果

2.1 Ndrg1在不同體節(jié)中的表達(dá)

為了檢測(cè)Ndrg1在體節(jié)發(fā)生過程中的表達(dá)情況，我們通過使用地高辛標(biāo)記的Ndrg1、Ndrg2和FGF－8探針對(duì)10.5 d的胚胎進(jìn)行整體原位雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明胚胎期10.5 d Ndrg1在頸椎和胸椎體節(jié)處顯著表達(dá)，在腰椎和骶椎體節(jié)處表達(dá)較弱（圖1a），而Ndrg2則在腰椎和骶椎體節(jié)處表達(dá)較強(qiáng)，在頸椎和胸椎體節(jié)處表達(dá)較弱（圖1b）。在該階段，Ndrg1并未在肢芽由FGF－8標(biāo)記的前原節(jié)中胚層中出現(xiàn)（圖1c）?？傮w上，在體節(jié)中Ndrg1表達(dá)部分與Ndrg2疊加，但又與Ndrg2表達(dá)有明顯區(qū)別。

2.2 Ndrg1缺失對(duì)腰椎至骶椎同源轉(zhuǎn)換的影響

為了獲得Ndrg1－／－鼠，我們引進(jìn)了攜帶條件性等位基因Ndrg1fl／fl的小鼠。該等位基因在第1個(gè)外顯子兩邊插入Loxp片段及pGKneo篩選基因（圖2a）。我們將攜帶條件性等位基因Ndrg1fl／fl的小鼠與Actin－Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交。經(jīng)過幾個(gè)步驟的回交，得到Ndrg1－／－鼠（圖2b）。雜合子和基因敲除小鼠可以通過引物P1／P2／P3進(jìn)行基因型鑒定（圖2c）。通過qRT－PCR測(cè)試，Ndrg1基因敲除率達(dá)到90%左右（圖2d）。Ndrg1－／－鼠是可育的，且無明顯生長(zhǎng)缺陷。然而，Ndrg1－／－鼠在腰椎至骶椎的過渡區(qū)域出現(xiàn)同源轉(zhuǎn)換（下頁圖3）。在野生型鼠中，中軸骨常由7塊頸椎（C1～C7）、13塊胸椎（T1～T13）、6塊腰椎（L1～L6）、4塊骶椎（S1～S4）和一定數(shù)量的尾椎組成。Ndrg1－／－鼠頸椎、胸椎和尾椎的數(shù)量和組織排列與野生型鼠相同，但其L6形態(tài)與野生型鼠S1部分相似，出現(xiàn)不同程度的L6～S1同源轉(zhuǎn)換（下頁圖3）。

圖1 胚胎期10.5 d Ndrg1、Ndrg2在分化體節(jié)中的表達(dá) a.Ndrg1在頸椎和胸椎體節(jié)處表達(dá)水平較高 b.Ndrg2在腰椎和骶椎體節(jié)處表達(dá)水平較高 c.由FGF－8標(biāo)記的前原節(jié)中胚層

圖2 Ndrg1－／－鼠制備和基因型鑒定 a.Ndrg1fl／fl等位基因結(jié)構(gòu)，Loxp位點(diǎn)被插入第1外顯子Ndrg1啟動(dòng)子上游和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游 b.Ndrg1－／－鼠由Ndrg1fl／fl鼠于Actin－Cre鼠雜交獲得 c.野生型鼠和Ndrg1－／－鼠基因型鑒定 d.采用qRT－PCR分析Ndrg1基因敲除率

我們的前期研究顯示，Ndrg2－／－鼠也出現(xiàn)與Ndrg1－／－鼠類似的 L6～S1同源轉(zhuǎn)換。此外，Ndrg2－／－鼠在T9～T10、T13～L1和S4～C1過渡區(qū)域也發(fā)生椎體同源轉(zhuǎn)換。為了檢測(cè)Ndrg1和Ndrg2在體節(jié)特化過程中是否有疊加作用，我們比較了 Ndrg1／2－／－ 鼠和 Ndrg1－／－ 鼠的椎體結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示在Ndrg1／2－／－鼠L6～S1存在相似的椎體同源 轉(zhuǎn) 換，但 Ndrg1／2－／－ 鼠 與 Ndrg1－／－ 鼠、Ndrg2－／－鼠相比并無額外的缺陷（圖2），或者說，Ndrg1／2－／－鼠除 L6～S1椎體同源轉(zhuǎn)換外，Ndrg1缺失反而彌補(bǔ)了Ndrg2缺失引起的T13～L1和S4～C1區(qū)域椎體同源轉(zhuǎn)變。

2.3 Ndrg1缺失與 Hoxc8－11基因表達(dá)

圖3 Ndrg1－／－、Ndrg1／2－／－鼠椎體同源轉(zhuǎn)換 a～d1.腰椎和骶椎背視圖，包括野生型鼠腰椎（a）和骶椎 （a1）、中度突變Ndrg1－／－鼠腰椎（b）和骶椎 （b1）、嚴(yán)重突變 Ndrg1－／－鼠腰椎（c）和骶椎 （c1）、Ndrg1／2－／－鼠腰椎（d）和骶椎 （d1） e.L1～S2椎體背視圖，其中＊表示發(fā)生轉(zhuǎn)變的椎體，在Ndrg1－／－、Ndrg1／2－／－鼠中L6的結(jié)構(gòu)與S1的結(jié)構(gòu)相似（紅色箭頭指示），所有骨架均于出生后6 d收集（其中 Ndrg1－／－鼠10只，Ndrg1／2－／－ 鼠6只）

圖4 Ndrg1－／－鼠胚胎中Hoxc8～11基因表達(dá)情況 a～h.應(yīng)用整體原位雜交技術(shù)檢測(cè)胚胎期10.5 d Ndrg1－／－鼠Hoxc8～11基因表達(dá)，其中△表示體節(jié)處基因表達(dá)明顯改變（n＝3） i.經(jīng)qRT－PCR技術(shù)檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，胚胎期10.5 d Ndrg1－／－鼠后面體節(jié)Hoxc8表達(dá)水平下降，而Hoxc9～11基因表達(dá)水平上升 （n＝3）（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，以β－actin基因?yàn)閮?nèi)參范圍）

為了探索Ndrg1－／－鼠中椎體同源轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制，我們應(yīng)用整體胚胎原位雜交和qRT－PCR技術(shù)檢測(cè)胚胎期10.5 d Ndrg1－／－鼠 Hoxc8、Hoxc9、Hoxc10和Hoxc11表達(dá)模式，結(jié)果顯示10.5 d的胚胎從頸椎至尾椎體節(jié)經(jīng)歷著成骨、成軟骨分化，與對(duì)照組相比，Ndrg1－／－鼠Hoxc8表達(dá)水平增加，而Hoxc9、Hoxc10和Hoxc11表達(dá)水平卻有所下降（圖4），表明Ndrg1至少部分通過調(diào)節(jié)Hoxc8～11基因表達(dá)水平來調(diào)控椎體特化。

3 討論

Ndrg1是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，涉及多種癌癥發(fā)生發(fā)展［9，12－14］。在 臨 床 上，目前尚 無 關(guān) 于 Ndrg1 基因表達(dá)缺陷與脊柱疾病等方面的報(bào)道。

在此項(xiàng)研究中，我們通過使用Ndrg1－／－鼠來研究Ndrg1基因在調(diào)控椎體特化過程中的功能，Ndrg1和Ndrg2的表達(dá)在分化體節(jié)中部分重疊，但與Ndrg2相比，Ndrg1在前部體節(jié)中表達(dá)水平較高；Ndrg1－／－鼠和 Ndrg2－／－鼠均出現(xiàn)腰椎與胸椎過渡區(qū)域L6～S1椎體同源缺陷；在脊椎發(fā)育過程中，Ndrg1－／－鼠的缺陷表型不及 Ndrg2－／－鼠明顯，Ndrg1／2－／－鼠椎體特化缺陷與 Ndrg1－／－鼠一致，Ndrg2－／－鼠其他椎體缺陷如T13～L1和S3～S4過渡區(qū)域椎體同源轉(zhuǎn)變?cè)贜drg1／2－／－鼠中并未發(fā)現(xiàn)，也可以說，Ndrg1的缺失部分挽救了Ndrg2－／－鼠表型。總的來說，雖然Ndrg1的表達(dá)譜及功能與Ndrg2部分相似，但兩者的作用不具有冗余性。

研究［18］報(bào)道，Hox基因簇的重要標(biāo)志之一是它們?cè)谌旧w上的線性排列與其在早期發(fā)育中的表達(dá)時(shí)間點(diǎn)和前后軸邊界直接相關(guān)。椎體同源轉(zhuǎn)換通常與Hox基因表達(dá)邊界改變有關(guān)。Ndrg1－／－鼠椎體同源轉(zhuǎn)換與Hoxc8～11基因表達(dá)水平改變有關(guān)。與對(duì)照組相比，Ndrg1－／－鼠胚胎體節(jié)中 Hoxc8表達(dá)水平升高，而Hoxc9～11表達(dá)水平下降。而體節(jié)中Hoxc8或Hoxc9基因的缺失會(huì)導(dǎo)致L1～T13及T10～T13過渡區(qū)域椎體同源轉(zhuǎn)換［8，19］，但這些表型均未在 Ndrg1－／－鼠中觀察到。然而，Hoxc10、Hoxc11缺失鼠表現(xiàn)出與Ndrg1－／－鼠和Ndrg2－／－鼠一些相似的椎體同源轉(zhuǎn)換［20－21］。值得注意的是，在Ndrg1－／－鼠體節(jié)中檢測(cè)到的是Hoxc8～11轉(zhuǎn)錄水平的改變，而非表達(dá)邊界的改變。Hox基因表達(dá)邊界大多先于體 節(jié)分割［4，22－23］。因此，我們推測(cè)Hox基因表達(dá)水平的組合改變即使不是唯一，也能部分解釋Ndrg1－／－鼠中的椎體同源轉(zhuǎn)換。

總之，這些結(jié)果表明Ndrg1基因部分通過調(diào)節(jié)Hoxc8～11基因表達(dá)水平調(diào)控腰椎和胸椎過渡區(qū)域椎體同源轉(zhuǎn)換。值得注意的是，Ndrg1基因在前部體節(jié)中表達(dá)較高，但其功能卻在后部體節(jié)如腰、骶椎中更顯著。這提示，在椎體分化早期階段，Ndrg1可能與其他調(diào)控子一起發(fā)揮作用。在脊椎發(fā)育過程中，Ndrg基因家族其他成員如Ndrg3、Ndrg4也在體節(jié)和尾牙處有表達(dá)［24］。然而，目前還沒有關(guān)于Ndrg3－／－、Ndrg4－／－小鼠在脊椎發(fā)育過程中相關(guān)功能的報(bào)道，關(guān)于Ndrg1、Ndrg3、Ndrg4在椎體特化過程中是否相互作用，仍需進(jìn)一步研究。

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