萬 敏 李必生 鄒 婧 歐日晶 侯 強 曲守方 黃 杰，＊

1.華北石油管理局總醫(yī)院檢驗科（任丘，062550）；2.深圳華大基因研究院；3.中國食品藥品檢定研究院

人乳頭瘤病毒（HPV）屬雙鏈閉環(huán)的小DNA病毒，包含約8000個堿基對［1］。HPV根據(jù)編碼衣殼蛋白L1基因的開放讀碼框（ORF）序列不同進行分型［2］。高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要因素［3－4］，在99.7%的宮頸癌患者病變組織中可發(fā)現(xiàn)高危型的 HPV感染［5］。目前還缺乏針對 HPV公認的有效治療手段，因此高危型HPV早發(fā)現(xiàn)、早預防是阻斷癌變的關鍵。截止2014年，國內(nèi)已經(jīng)獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準上市的HPV核酸檢測試劑盒共有50多種［6］，涉及的檢測方法包括PCR－熒光探針法，PCR－反向斑點雜交法、基因芯片法、PCR－表面等離子諧振法、雜交捕獲－化學發(fā)光法等。由于方法學的限制，分型檢測多個HPV型別需要數(shù)個反應才能完成，檢測通量大幅下降，成本也將提高。因此大部分HPV核酸檢測試劑盒僅檢測少數(shù)型別，或只定性檢測而不進行HPV分型。近年來，新一代高通量測序技術發(fā)展迅速，涌現(xiàn)了多種先進的測序方法［7－9］，這些技術已經(jīng)在胎兒染色體非整倍體檢測、單基因遺傳病檢測、遺傳性腫瘤基因檢測等臨床檢測中得到了應用［10－12］。目前半導體測序技術已經(jīng)應用于HPV核酸分型檢測中，通過對HPV的L1區(qū)基因保守序列進行測序及序列差異分析，實現(xiàn)了單個反應可對16種HPV型別（HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）同時分型檢測，極大提高了檢測的通量并降低了成本。本研究采用中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑一室研制的HPV L1基因分型國家參考品及HPV全基因組分型國家參考品對半導體測序法HPV核酸分型檢測技術進行準確性、特異性、重復性及最低檢測限等分析性能評估。同時采用已上市的HPV核酸檢測試劑盒作為對照試劑盒，評估該技術檢測臨床樣本的陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及一致性系數(shù)（Kappa）值，評價該技術與臨床檢測方法的等效性。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

HPV L1基因分型國家參考品包括30種HPV型別質(zhì)粒，其中14種高危型 HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73），3種中等危險型（26、53、66）和13種低危型 HPV（6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81、83、CP8304）；HPV 全基因組分型國家參考品包括20種HPV型別質(zhì)粒及5個陰性參考品，去除與HPV L1區(qū)分型參考品重復的型別，從中選取 HPV 67、69、71、82型質(zhì)粒以及陰性參考品N1－N5用于性能評估試驗，以上國家參考品均由中國食品藥品檢定研究院提供。選取華北石油管理局總醫(yī)院提供的500例檢測剩余的宮頸脫落細胞DNA樣本用于臨床檢測性能評估，所有樣本均已使用HPV基因分型（23型）檢測試劑盒（PCR－反向點雜交法，亞能生物技術（深圳）有限公司，注冊證號：國食藥監(jiān)械（準）字2014第3401228號）進行HPV核酸分型檢測，總計200例陰性樣本、300例陽性樣本，陽性樣本HPV型別均已知。

1.2 主要儀器與試劑

9700PCR儀購置于ABI公司；生物分析儀2100購置于安捷倫公司；Ion One TouchTM制備儀及Ion One TouchTMES純化儀購置于 Life Technologies公司；基因測序儀（BGISEQ－100）購置于武漢華大基因生物醫(yī)學工程有限公司。PCR及測序文庫構建采用華大基因研究院研制的HPV（16種型別）核酸分型檢測試劑盒（半導體測序法）；半導體測序采用華大生物科技（武漢）有限公司生產(chǎn)的BGISEQ－100測序反應通用試劑盒（注冊證號：鄂漢食藥監(jiān)械（準）字2014第1400030號）。

1.3 基于半導體測序法的HPV核酸分型檢測技術

1.3.1 多重PCR反應 使用HPV（16種型別）核酸分型檢測試劑盒（半導體測序法）中的PCR試劑擴增樣本中的HPV DNA。多重PCR擴增引物根據(jù)HPV編碼晚期蛋白的L1區(qū)基因保守序列設計，保證16種HPV型別均可有效擴增，同時上下游引物的5’端均加入了10bp的樣本標簽序列，用于數(shù)據(jù)分析中的樣本序列識別。

1.3.2 文庫構建 將帶有不同樣本標簽序列的96個樣本的PCR產(chǎn)物等比例混合成為一個文庫樣本。使用HPV（16種型別）核酸分型檢測試劑盒（半導體測序法）中的建庫試劑對文庫樣本進行磁珠純化、末端修復反應及接頭連接反應，使每個文庫樣本中的DNA序列兩端均加上用于測序及文庫識別的接頭序列。經(jīng)過生物分析儀2100檢測后，將多個文庫樣本按等物質(zhì)的量比例混合為一個測序樣本。

1.3.3 DNA測序 將測序樣本稀釋，使用BGISEQ－100測序反應通用試劑盒對測序樣本進行油包水PCR反應，使每個DNA分子僅與單個測序微珠相連并在微珠表面擴增，以放大測序信號。反應完成后將微珠富集并清洗，再加入測序引物退火，使測序引物與微珠表面的DNA中的接頭退火結合，最后將產(chǎn)物加入測序芯片中，采用基因測序儀（BGISEQ－100）對測序樣本DNA進行序列信息讀取。半導體測序法采用邊合成邊測序的技術，通過成熟的半導體技術檢測DNA鏈在合成過程中的pH值改變，并將這種變化轉化為電子信號，實時記錄反應過程中的電子信號有無及強度，從而獲得DNA鏈中的堿基序列。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 使用HPV核酸分型分析軟件對測序數(shù)據(jù)進行分析，每一條DNA的測序結果經(jīng)過文庫接頭序列及樣本標簽序列的比對拆分后將被精確定位到每一個樣本中。將每個樣本的DNA測序結果與標準數(shù)據(jù)庫中的各種HPV型別序列進行比對分析，統(tǒng)計每個樣本比對到16種HPV型別的序列數(shù)量，若某樣本的某一HPV型別的序列數(shù)高于該HPV型別的閾值，判斷該樣本為該HPV型別陽性，若低于閾值判斷為該HPV型別陰性。

1.4 性能評估

技術性能評估試驗設計參考了YY／T 1226－2014《HPV核酸（分型）檢測試劑（盒）》醫(yī)療器械行業(yè)標準的技術要求及試驗方法。由于標準中沒有針對于基因測序方法進行HPV分型檢測的相關要求，因此綜合了所有方法的要求設計了評估試驗。

1.4.1 準確性 使用2ng／μl人基因組TE溶液將HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型的L1基因分型國家參考品（1000拷貝／μl）稀釋至100拷貝／μl的溶液。檢測以上稀釋液，要求檢測結果應為對應HPV型別陽性。

1.4.2 特異性 使用2ng／μl人基因組TE溶液將HPV 26、40、42、43、44、53、54、61、66、70、72、81、83、CP8304型的L1基因分型國家參考品及HPV 67、69、71、82型的全基因組分型國家參考品（1000拷貝／μL）稀釋至100拷貝／μl的溶液。檢測以上稀釋液及陰性參考品N1～N5，要求檢驗結果應均為陰性。

1.4.3 重復性 采用2ng／μl人基因組TE溶液將HPV11、16型的L1基因分型國家參考品（1000拷貝／μl）稀釋至100拷貝／μl的溶液。重復檢測以上稀釋液各10次，要求10次的檢測結果均一致且為對應HPV型別陽性。

1.4.4 最低檢測限 采用2ng／μl人基因組TE溶液將 HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 型的 L1基因分型國家參考品（1000拷貝／μl）梯度稀釋至100拷貝／μl、10拷貝／μl、1拷貝／μl的溶液。重復檢測以上梯度稀釋液各3次，確定最低檢測限。要求＜104拷貝／反應。

1.5 臨床檢測等效性評估方法

使用半導體測序法檢測500例臨床宮頸脫落細胞DNA樣本，按照本方法檢測范圍內(nèi)的16種HPV型別將試驗對象分為16類。以HPV16型分型檢測結果分析為例，已知結果為HPV16型的受試者樣本作為陽性樣本組，已知結果為非HPV16型感染或HPV感染陰性的受試者樣本作為陰性樣本組。按照表1分別將16組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計記錄。

表1 檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計表

按照以下公式計算檢測結果與已知結果的陽性符合率、陰性符合率、總符合率、一致性系數(shù)（Kappa）值及各值的95%置信區(qū)間。

2 結果

2.1 分析性能評估

2.1.1 準確性 采用基于半導體測序法的HPV核酸分型技術檢測100拷貝／μl的 HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型 L1基因分型國家參考品稀釋液，檢測結果均為對應HPV型別陽性，準確率為100%。結果表明該技術可以準確檢測16種HPV型別，具有很好的檢測準確性。

2.1.2 特異性 檢測100拷貝／μl的 HPV26、40、42、43、44、53、54、61、66、70、72、81、83、CP8304 型L1基因分型國家參考品稀釋液及100拷貝／μl的HPV67、69、71、82型的全基因組分型國家參考品稀釋液，檢測結果均為HPV陰性。檢測N1～N5共5例陰性參考品，檢測結果均為HPV陰性。結果表明該方法與檢測范圍以外的其他HPV型別無交叉反應，與人基因組DNA也無交叉反應，具有較好的檢測特異性。

2.1.3 重復性 重復檢測100拷貝／μl的 HPV11及HPV16型L1基因分型國家參考品稀釋液各10次，10次的檢測結果均一致且為對應HPV型別陽性，重復率為100%。結果表明該技術具有較好的檢測重復性。

2.1.4 最低檢測限 結果顯示，濃度為100拷貝／μl及10拷貝／μl的16種HPV型別國家參考品稀釋液的3次結果均一致且為對應HPV型別陽性，檢出率均為100%，而濃度為1拷貝／μl的國家參考品稀釋液僅HPV16型檢出一次陽性。因此確定該技術的最低檢測限為10拷貝／μl（即50拷貝／反應），符合行業(yè)標準要求。

2.2 臨床檢測等效性評估

500例樣本的測序檢測統(tǒng)計結果顯示，半導體測序法與已知結果的總體陽性符合率為99.33%（298／300），陰性符合率為100%（200／200），總符合率為99.60%（498／500），Kappa值為0.99，兩種檢測方法具有較高的一致性。按照16種HPV型別進行分組統(tǒng)計陽性符合率、陰性符合率、總符合率以及Kappa值。HPV52、56、58型的陽性符合率分別為98.25%（56／57）、94.74%（18／19），97.56%（40／41），其他 HPV型別的陽性符合率均為100%；HPV11、16、52、59、68 型的陰性符合 率 分別 為99.79% （484／485）、99.55% （444／446）、99.55%（441／443）、99.80%（487／488）、99.38%（482／485），其他HPV型別的陰性符合率均為100%；HPV11、16、52、56、58、59、68型的總符合率分別為99.80%（499／500）、99.60%（498／500）、99.40%（497／500）、99.80% （499／500）、99.80% （499／500）、99.80%（499／500）、99.40%（497／500），其他 HPV 型別的總符合率均為100%；16種HPV型別的Kappa值均＞0.95，表明半導體測序法在檢測16種HPV型別方面與臨床檢測技術具有較高的一致性。12例不一致樣本的檢測結果與已知結果的比較見表2。結果顯示，前10例樣本的兩種檢測方法結果均為HPV陽性，僅為HPV型別的差異，其中9例半導體測序法檢出了更多的HPV型別，包括了HPV11、HPV16、HPV52、HPV59、HPV68型；其中1例半導體測序法未檢出HPV56型。后2例樣本的半導體測序法檢測結果為陰性，而已知結果分別為HPV52、HPV58型。

表2 不一致樣本的檢測結果與已知結果比較

3 討論

本研究采用了HPV分型國家參考品進行半導體測序法的技術性能評估，測試的范圍涵蓋了34種臨床常見的高危型及低危型HPV型別。結果顯示基于半導體測序法的HPV核酸分型檢測技術可準確分型檢測16種 HPV型別（HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68），檢測范圍內(nèi)的16種HPV型別之間無交叉反應，與其他HPV型別及人類基因組DNA亦無交叉反應，最低檢測限為10拷貝／μl（即50拷貝／反應），具有很好的檢測準確性、特異性及重復性，符合國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的 YY／T 1226－2014《HPV核酸（分型）檢測試劑（盒）》醫(yī)療器械行業(yè)標準要求。

本研究同時采用了500例臨床宮頸脫落細胞樣本進行臨床檢測性能的研究。結果顯示半導體測序法在檢測臨床樣本方面與臨床檢測技術具有較高的一致性。12例結果不一致的樣本涉及的型別包括HPV11、16、52、56、58、59、68型。分析半導體測序數(shù)據(jù)，樣本1～6中不一致的HPV型別的檢測數(shù)值與檢測閾值的比值大部分為1～2，即檢測值較接近閾值，分析可能導致這6例樣本不符合的原因為：在多重感染的情況下，容易出現(xiàn)PCR引物競爭性抑制的情況，而不一致的HPV型別拷貝數(shù)較低，擴增效率較低，導致探針反向雜交顯色時未檢出低拷貝型別。樣本7～9的不一致型別均為HPV68型且比值均為10，說明HPV68型拷貝數(shù)較高，導致已知結果中未檢測HPV68型的原因可能為：這3例樣本中的HPV68型序列在探針結合部分存在堿基突變，導致探針無法結合或結合不佳，而半導體測序法直接檢測所有序列后通過與標準序列比對判斷具體HPV型別，因此不受個別堿基突變的影響。樣本10～12的不一致HPV型別的比值均為0，說明半導體測序法未擴增出對應的HPV型別序列，可能的原因為樣本保存不當導致DNA降解，也可能為引物結合部分序列突變導致PCR擴增失敗。

HPV核酸分型檢測技術具有準確性高、重復性高、漏檢率低的特點，而且可根據(jù)感染的HPV類型預測受檢者的宮頸癌患病風險度。美國癌癥協(xié)會等在2012年發(fā)布的關于宮頸癌預防及早期診斷的篩查指南中推薦，在＞30歲的女性中使用HPV檢測以及細胞學方法聯(lián)合進行篩查［12］。由于在高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變中HPV16及HPV18型感染率較高［13］，為了提高篩查效率，有研究建議根據(jù)HPV分型檢測結果，HPV16和（或）HPV18陽性患者直接分流進行陰道鏡檢測，其他高危型HPV陽性患者進行細胞學檢查，以降低篩查成本及陽性復查和干預人數(shù)［14］。HPV核酸分型檢測技術還可用于意義不明的非典型鱗狀上皮細胞（ASCUS）病例的分流、宮頸病變患者手術后隨訪，為區(qū)域性HPV流行病學調(diào)查提供可靠的依據(jù)［15］。

基于半導體測序法的HPV核酸分型檢測技術分型準確，檢測通量高，通過96套樣本標簽及50套文庫標簽協(xié)同標記不同樣本，單次可同時檢測4800份樣本，極大提高了檢測通量，同時降低了檢測成本，為區(qū)域性人群宮頸癌篩查及HPV流行病學調(diào)查提供強有力的檢測手段。該技術可以直接進行HPV分型，對于HPV16、HPV18等致癌性更強亞型感染者的臨床干預進行分流，相當于在初篩的同時完成了二次篩查，具有較高的臨床應用價值。今后的研究將進一步針對該技術在宮頸癌篩查方面的性能進行。

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