宗紹波，呂耀中，孫 蘭，李卓瓊，周 軍，畢宇安，王振中，蕭 偉**

1江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司；2中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，連云港 222001

加味藿香正氣軟膠囊對(duì)細(xì)菌性腸炎炎性因子的影響*

宗紹波1，2，呂耀中1，2，孫 蘭1，2，李卓瓊1，2，周 軍1，2，畢宇安1，2，王振中1，2，蕭 偉1，2**

1江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司；2中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，連云港 222001

目的：觀察加味藿香正氣軟膠囊對(duì)細(xì)菌性腸炎大鼠炎癥細(xì)胞因子的影響，探討加味藿香正氣軟膠囊治療細(xì)菌性腸炎的免疫機(jī)制。方法：70只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、藿香正氣軟膠囊組（0.324 g·kg-1）、柳氮磺吡啶腸溶片組（0.225 g·kg-1）、加味藿香正氣軟膠囊高、中、低劑量組（4.66、2.33、1.16 g·kg-1），除正常組外，其他各組采用細(xì)菌菌株法復(fù)制細(xì)菌性腸炎模型。各治療組于第3次注射后，連續(xù)灌胃給藥2周，放射免疫測(cè)定法檢測(cè)各組大鼠血清中IL-1β、IL-10和TNF-α含量。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-1β和TNF-α含量均顯著升高（P< 0.01），IL-10含量顯著降低（P<0.01）；與模型組相比較，除加味藿香正氣軟膠囊低劑量組外，其它各組大鼠血清中IL-1β和TNF-α含量均顯著降低 （P<0.01或P<0.05）；柳氮磺吡啶腸溶片組（LDH）、加味藿香正氣軟膠囊高劑量組（JWG）、加味藿香正氣軟膠囊中劑量組（JWZ）大鼠血清中IL-10含量均顯著增加（P<0.05，P<0.05，P<0.01）。結(jié)論：加味藿香正氣軟膠囊對(duì)細(xì)菌性腸炎具有治療作用，其機(jī)制可能與IL-10、IL-1β和TNF-α等細(xì)胞因子水平調(diào)節(jié)相關(guān)。

加味藿香正氣軟膠囊；炎癥性腸炎；細(xì)胞因子

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和Crohn’s病（Crohn’s disease，CD），是一種尚未完全明確，一般認(rèn)為慢性腸道炎癥性疾病。現(xiàn)在普遍認(rèn)為發(fā)病機(jī)制涉及遺傳易感性、環(huán)境因素、免疫異常、腸道菌群改變等多個(gè)方面，其中免疫失衡或者異常對(duì)慢性炎癥至關(guān)重要[1]?，F(xiàn)代免疫學(xué)研究表明，細(xì)胞因子平衡失調(diào)所致的免疫異常是IBD的重要發(fā)病機(jī)制[2]。加味藿香正氣軟膠囊源自《太平惠民和劑局方》中的藿香正氣散，主要由藿香、厚樸和茯苓等13味中藥組成[3]，并增加生姜和大棗兩味中藥用于調(diào)和脾胃，具有解表化濕、理氣和中的功效，目前被臨床廣泛用于急慢性腸炎的治療。因此本實(shí)驗(yàn)采用大鼠結(jié)腸細(xì)菌菌株法復(fù)制IBD大鼠模型，考察加味藿香正氣軟膠囊對(duì)大鼠血清中細(xì)胞因子含量的影響，從而探討加味藿香正氣軟膠囊對(duì)細(xì)菌性腸炎的免疫系統(tǒng)的影響，為其機(jī)制研究和臨床用藥提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器

CENTRFUGE5840型冷凍離心機(jī)（eppendorf）；nfinite M200Pro酶標(biāo)儀 （TECAN公司）；r-911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀（中國科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠）；恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 藥物

加味藿香正氣軟膠囊（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.6 g/粒，相當(dāng)于飲片2.157 g，批號(hào)：130705）；柳氮磺吡啶腸溶片（上海福達(dá)制藥有限公司，規(guī)格：0.25 g/片，批號(hào)：22130809）；藿香正氣軟膠囊 （神威藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.45 g/粒，批號(hào)：12032231）。

1.3 試劑

IL-1β放免藥盒 （批號(hào)HY-10101）、TNF-α放免藥盒 （批號(hào)HY-10116），IL-10放免藥盒 （批號(hào)HY-10107），北京華英生物技術(shù)研究所；MH營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（規(guī)格：100 g/瓶，批號(hào)：201111072），MH瓊脂（規(guī)格：100 g/瓶，批號(hào)：201006081），廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.4 動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，雄性，體重160～180 g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016。

大腸桿菌（連云港第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科提供）。

2 方 法

將大腸桿菌分別用營養(yǎng)肉湯在37℃、130 r· min-1培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)18 h，在600 nm酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度，根據(jù)公式：菌液濃度=吸光度（OD值）×6× 109×稀釋倍數(shù)。調(diào)整菌液的濃度至1×109個(gè)/mL，菌液在接種前新鮮配制。

隨機(jī)選取10只大鼠為正常組，其它大鼠依據(jù)參考文獻(xiàn)[4]分別于第1、10、17、24天共接受4次免疫。第1天于每只大鼠后足跖處注射大腸桿菌細(xì)菌抗原物質(zhì)0．2 mL；第10天、第17天分別于每只大鼠腹部和背部皮下多點(diǎn)注射0．4 mL和0．6 mL；第24天于每只大鼠腹腔內(nèi)注射1．2 mL。動(dòng)物在第2次免疫前每只大鼠灌胃給予新鮮配制的大腸桿菌細(xì)菌懸液1．5 mL（濃度同前），于第3次注射細(xì)菌懸液前隨機(jī)分為6組，分別為模型組、柳氮磺吡啶腸溶片組（0．225 g·kg-1，LDH）、藿香正氣軟膠囊組（0．324 g內(nèi)容物/kg，HX）、加味藿香正氣軟膠囊高劑量組（4．66 g生藥/kg，JWG）、加味藿香正氣軟膠囊中劑量組（2．33 g生藥/kg，JWZ）、加味藿香正氣軟膠囊低劑量組（1．16 g生藥/kg，JWD），每組10只大鼠。正常組和模型組灌胃給予0．5%CMC-Na混懸液；其他組給予相應(yīng)的藥物，給藥體積為10 mL·kg-1；每天1次，連續(xù)14 d。各組大鼠末次灌胃24 h后取材檢測(cè)，前一天禁食不禁水12 h，10%水合氯醛麻醉動(dòng)物，腹主動(dòng)脈采血5 mL于未加抗凝劑試管中，3000 r·min-1離心10 min，取上層血清保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明書檢測(cè)IL-1β、IL-10、TNF-α含量。

3 結(jié) 果

3.1 對(duì)模型大鼠血清中IL-1β含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（見圖1），與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-1β含量顯著升高（P＜0．01）；與模型組比較，LDH組、HX組、JWG組、JWZ組大鼠血清中IL-1β含量均顯著降低（P＜0．01，P＜0．05，P＜0．01，P＜0．05）。與JWD組無顯著性差異。

3.2 對(duì)模型大鼠血清中TNF-α含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（見圖2），與正常組比較，模型組大鼠血清中TNF-α含量顯著升高（P＜0．01）；與模型組比較，LDH組、HX組、JWG組、JWZ組大鼠血清中 TNF-α含量均顯著降低 （P＜0．01，P＜0．01，P＜0．01，P＜0．05），與JWD組無顯著性差異。

3.3 對(duì)模型大鼠血清中IL-10含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（見圖3），與正常組相比較，模型組大鼠血清中IL-10含量顯著下降（P＜0．01）；與模型組比較，LDH組、JWG組、JWZ組大鼠血清中IL-10含量均顯著增加（P＜0．05，P＜0．05，P＜0．01），其他各組均無顯著性差異。

圖3 各組大鼠血清IL-10含量

4 討 論

大量研究表明，腸道共生菌落和腸道黏膜免疫系統(tǒng)之間的平衡紊亂是IBD發(fā)生的重要誘因[5]。腸道內(nèi)菌群失調(diào)往往伴隨著黏膜屏障功能損傷及其免疫調(diào)節(jié)異常，大量腸道內(nèi)共生菌落抗原可以特異性激活腸道黏膜內(nèi)淋巴細(xì)胞，并誘導(dǎo)其增殖分化，表現(xiàn)為無節(jié)制的免疫反應(yīng)和免疫失調(diào)的免疫學(xué)特性[6]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠結(jié)腸細(xì)菌菌株法復(fù)制IBD大鼠模型，通過注射細(xì)菌抗原物質(zhì)結(jié)合灌服大腸桿菌細(xì)菌懸液，造成腸道菌群失調(diào)并激活腸黏膜的免疫系統(tǒng)，能較好的模擬臨床癥狀，有助于闡明細(xì)胞免疫在IBD中的作用機(jī)制。

細(xì)胞因子作為細(xì)胞間的信號(hào)傳遞分子，在腸黏膜免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。在臨床慢性腸炎患者結(jié)腸黏膜中能夠檢測(cè)到大量的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，其均能釋放大量的細(xì)胞因子。IL-1和TNF-α屬于促炎細(xì)胞因子，主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，參與細(xì)胞免疫反應(yīng)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)；TNF-α能夠誘導(dǎo)NO合成酶產(chǎn)生，而過量的NO損傷組織和細(xì)胞，介導(dǎo)腸道動(dòng)脈充血等，損傷腸道黏膜屏障，加重炎癥病變。大量研究發(fā)現(xiàn)，處于潰瘍性結(jié)腸炎活動(dòng)期的患者血漿中IL-1β和TNF-α含量均顯著升高[7]。IL-10屬于抗炎細(xì)胞因子，主要有Th2細(xì)胞產(chǎn)生，參與體液免疫反應(yīng)，能夠抑制Th1細(xì)胞功能，抑制炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，造模后大鼠血清中IL-1和TNF-α含量顯著升高，IL-10含量顯著降低；加味藿香正氣軟膠囊給藥干預(yù)后，加味藿香正氣軟膠囊高、中劑量組大鼠血清中IL-1和TNF-α含量顯著降低，而IL-10含量升高，表明能夠同時(shí)調(diào)節(jié)促炎因子和抗炎因子的產(chǎn)生和釋放，對(duì)免疫系統(tǒng)平衡狀態(tài)的恢復(fù)具有調(diào)節(jié)作用，其改善作用與柳氮磺吡啶腸溶片相近；其次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加味藿香正氣軟膠囊對(duì)抗炎因子IL-10含量上調(diào)作用優(yōu)于藿香正氣軟膠囊。

綜上所述，加味藿香正氣軟膠囊對(duì)促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子均具有調(diào)節(jié)作用，能升高IL-10水平，降低IL-1β和TNF-α水平。因此我們認(rèn)為加味藿香正氣軟膠囊可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子體內(nèi)的平衡及保護(hù)胃腸道黏膜而發(fā)揮治療作用，但其調(diào)節(jié)和保護(hù)機(jī)制尚不明確，有待作進(jìn)一步研究。

[1]劉占舉．炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制新進(jìn)展[J]．內(nèi)科理論與實(shí)踐，2013，8（1）：5-8．

[2]Papadakis KA,Targan SR．Role of cytokines in the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J]．Annu Rev Med,2000,51(1):289-98．

[3]陸 茵，陳文星，孟政杰，等．加味藿香正氣軟膠囊調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)功能的作用[J]．中藥新藥與臨床藥理，2003，14（6）：381-3．

[4] 田振國．通腑寧顆粒對(duì)免疫法復(fù)制大鼠UC動(dòng)物模型影響的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中華中醫(yī)學(xué)刊，2007，25（7）：1325-6．

[5]Swidsinski A,Ladhoff A,Pernthaler A,et al．Mucosal flora in inflammatory bowel disease[J]．Gastroenterology, 2002,122(1):44-54．

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Effect of Jiawei Huoxiang Zhengqi Soft Capsule on Chemotactic Cytokine of Colitis in Rats*

ZONG Shao-bo1,2,LV Yao-zhong1,2,SUN Lan1,2,LI Zhuo-qiong1,2,ZHOU Jun1,2,BI Yu-an1,2, WANG Zhen-zhong1,2,XIAO Wei1,2**
1Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.,Ltd.;2State Key Laboratory of New Pharmaceutical Process for Tradi-tional Chinese Medicine,Lianyungang 222001

Objective:To probe the mechanism of Jiawei Huoxiang Zhengqi Soft Capsule for treatment of colitis through observing inflammatory cytokine in serum．Methods:Seventy rats were randomly divided into seven groups,such as control group,model group,Sulfasalazine Enteric-coated Tablets group(0．225 g· kg-1),Huoxiang Zhengqi Soft Capsule group (0．324 g·kg-1)and three dosage groups of Jiawei Huoxiang Zhengqi Soft Capsule (4．66 g·kg-1,2．33 g·kg-1,1．16 g·kg-1)．Except for the control group,the colitis model of rats was established with Colibacillus．After the third injection,the rats of the therapy groups were treated with indicated drugs by intragastric administration for two weeks．The levels of IL-1β,IL-10 and TNF-α in serum were measured by radioimmunoassay．Results:The levels of IL-1β and TNF-α in the model group were significantly higher than those in the normal group (P＜0．01),the level of IL-10 in the model group was significantly lower than that in the normal group (P＜0．01)．In comparison with the model group,the levels of IL-1β and TNF-α were significantly decreased except for rats in the lower dosage of Jiawei Huoxiang Zhengqi Soft Capsule group (P＜0．01,P＜0．05),the levels of IL-10 in the Sulfsalazine En-teric-coated Tablets group,high and middle dosage of Jiawei Huoxiang Zhengqi Soft Capsule groups were significantly increased (P＜0．05,P＜0．05,P＜0．01)．Conclusion:Jiawei Huoxiang Zhengqi Soft Capsule can improve bacterial inflammatory bowel disease by regulating the levels of IL-1β,IL-10 and TNF-α in vivo．

Jiawei Huoxiang Zhengqi Soft Capsule;Inflammatory bowel disease;Cytokine

R965

A

1673-7806（2015）03-229-03

國家國際合作專項(xiàng)（No.2013DFA31090）

宗紹波，男，碩士，從事藥理學(xué)研究E-mail:zongshaobo1985@163.com

* *

蕭偉，男，博士，研究員級(jí)高級(jí)工程師，研究方向：中藥新藥的研究與開發(fā) E-mail:kanionlunwen@163.com

2014-12-01

2015-01-18