高 晨，田立樁，朱文霞，劉玉虎，吳信篤，趙 昱，趙福貴

蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院1安寧分院神經(jīng)外科；2神經(jīng)外科；3安寧分院創(chuàng)傷外科，甘肅蘭州 730070

大鼠原代神經(jīng)細胞放射性損傷敏感性與ROS含量關系及依達拉奉的保護作用

高 晨1，田立樁2，朱文霞3，劉玉虎1，吳信篤1，趙 昱1，趙福貴1

蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院1安寧分院神經(jīng)外科；2神經(jīng)外科；3安寧分院創(chuàng)傷外科，甘肅蘭州 730070

目的：探討大鼠原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系放射性損傷敏感性與ROS含量關系以及依達拉奉的保護作用。方法：X射線單次照射來源于大鼠海馬的原代神經(jīng)元、星形膠質細胞以及星形膠質細胞-神經(jīng)元共培養(yǎng)體系，對比評價正常培養(yǎng)或依達拉奉干預與否條件下細胞死亡、凋亡以及活性氧（ROS）含量變化。結果：X射線照射引起原代神經(jīng)元培養(yǎng)體系ROS含量及細胞死亡率明顯升高。共培養(yǎng)體系細胞損傷較輕，星形膠質細胞培養(yǎng)體系則無明顯損傷。依達拉奉通過清除ROS可以阻止細胞死亡。結論：放射損傷后，原代神經(jīng)元培養(yǎng)體系ROS含量明顯增高，導致神經(jīng)元凋亡失調。依達拉奉通過清除ROS逆轉這一病理過程而產生神經(jīng)元保護作用，值得臨床推廣。

共培養(yǎng)；放射性損傷；活性氧；依達拉奉；神經(jīng)保護

頭頸部腫瘤的有效治療手段之一是放射治療，在殺傷腫瘤細胞的同時，隨之而來的放射性腦損傷也是目前各種放療手段均不能完全避免的副損傷。近年來影像診斷技術的進步使得放射性腦損傷的檢出率逐漸增加，成為不可忽視的醫(yī)源性損傷原因之一[1]。研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)各類細胞在射線照射后反應不盡相同。星形膠質細胞出現(xiàn)反應性增生[2]，小膠質細胞增殖并釋放出炎癥介質[3]，少突膠質細胞產生放射性脫髓鞘改變[4]并伴隨凋亡增加[5]，而血管內皮細胞肥大導致血管壁增厚[6]。神經(jīng)元在放射性損傷后出現(xiàn)大量凋亡[7]，尤其是海馬神經(jīng)元對放射線更為敏感，損傷后出現(xiàn)海馬依賴性進行性功能損害，在學習、記憶和空間信息處理等方面發(fā)生缺陷，其確切的機制尚不明確。以往研究表明，腦損傷后增殖的星形膠質細胞通過神經(jīng)內分泌及毒素清除作用而保持內環(huán)境穩(wěn)定并促進神經(jīng)元修復[8]，而腦損傷所致神經(jīng)元凋亡失調的重要機制之一是活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的爆發(fā)[9]。新型自由基清除劑依達拉奉（3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，EDA），通過清除自由基，抑制脂質過氧化，從而抑制腦細胞、血管內皮細胞、神經(jīng)細胞的氧化損傷，在顱腦損傷的臨床救治中顯示出良好的療效。本研究分別建立大鼠海馬原代神經(jīng)元、星形膠質細胞以及星形膠質細胞-神經(jīng)元共培養(yǎng)體系，對比檢測不同培養(yǎng)體系對放射性損傷的敏感性。隨后通過原代細胞ROS含量檢測，進一步探討放射性腦損傷可能機制以及依達拉奉的腦保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 胚胎海馬組織取自18 d胎鼠大腦，數(shù)量30只，用以建立原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)體系及星形膠質細胞-神經(jīng)元共培養(yǎng)體系。乳鼠海馬組織取自出生24 h內SD乳鼠大腦，數(shù)量10只，用以建立原代海馬星形膠質細胞培養(yǎng)體系。所有實驗動物均來源于蘭州大學實驗動物中心 [SCXK（甘）-0295]，動物實驗經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會書面同意，具備動物實驗資格，并嚴格遵循國際動物實驗指南。

1.1.2 主要試劑及儀器 除特別聲明以外，細胞培養(yǎng)所需試劑均購自Gibco公司；胎牛血清購自Hy-clone公司；阿糖胞苷、GlutaMax培養(yǎng)基補充物、多聚賴氨酸及L-谷氨酸均購自Sigma公司；DAPI購自Roche公司；依達拉奉購自南京先聲東元制藥有限公司，批號：H20031342；DCFH-DA試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所；AnnexinV異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC） 試 劑 盒 購 自Pharmingen公司。

制冰機（Scotsman，意大利）；直熱式CO2培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；C2共聚焦顯微鏡（Nikon，日本）；超凈工作臺（蘇州凈化設備儀器廠）；低溫離心機（Ep-pendorf，德國）；細胞爬片（Thermo，美國）；尼龍網(wǎng)（BD，美國）；培養(yǎng)板及培養(yǎng)皿（Nunc，美國）；流式細胞儀（Beckman，美國）。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠原代海馬星形膠質細胞-神經(jīng)元共培養(yǎng)體系 75%醫(yī)用乙醇浸泡處死胎鼠，在超凈臺的無菌環(huán)境下冰浴開顱整塊地取出腦組織，顯微鏡下鈍性分離留取海馬部位，仔細剝離棄去腦膜、血管等其余部位。將全部海馬組織放入玻璃培養(yǎng)皿中用4℃冰漢克斯平衡鹽溶液（HBSS緩沖液）反復沖洗，隨后用眼科剪刀將其剪成1 mm3大小的組織塊，加入用HBSS緩沖液稀釋的0．25%胰蛋白酶2 mL及脫氧核糖核酸酶Ⅰ，37℃培養(yǎng)箱消化30 min，HBSS緩沖液終止消化3次。組織懸液經(jīng)過200目尼龍網(wǎng)過濾后收集濾液。濾液離心后轉移至含有5%胎牛血清的Neurobasal-A培養(yǎng)基中 （含有0．5 mmol·L-1的L-谷氨酸，0．5 mmol·L-1的GlutaMax培養(yǎng)基補充物，100 U·mL-1青霉素+100 μg·mL-1鏈霉素，0．02%的B27血清補充物）利用巴斯德移液管吹打3次，充分混勻，再經(jīng)過孔徑為80 μm的尼龍網(wǎng)過濾。細胞懸液在室溫下1000 r·min-1離心3 min，棄去上清液，利用不含胎牛血清的Neurobasal-A培養(yǎng)基重懸，顯微鏡下用細胞計數(shù)板調整細胞濃度至1．5×106cells/mL，隨后種植于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿及細胞爬片上，放置在37℃，5%CO2，95%空氣，濕度維持在85%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞種植4～6 h后更新全部細胞培養(yǎng)基，隨后顯微鏡下觀察細胞生長狀況，每3～4天更新一半細胞培養(yǎng)基。在種植后的第4天，培養(yǎng)基中加入1．5 mmol·L-1亮氨酸甲酯去除小膠質細胞。培養(yǎng)3周后，細胞用于后續(xù)試驗。

1.2.2 建立大鼠原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)體系 高純度的大鼠原代神經(jīng)元培養(yǎng)體系建立與星形膠質細胞-神經(jīng)元共培養(yǎng)體系相同的胎鼠海馬細胞懸液。細胞懸液濃度、種植程序與星形膠質細胞-神經(jīng)元共培養(yǎng)體系相同。在細胞種植后72 h，通過在培養(yǎng)基內加入10 mmol·L-1的胞嘧啶阿糖胞苷及降低培養(yǎng)基中血清濃度來抑制星形膠質細胞的生長。培養(yǎng)3周后，細胞用于后續(xù)試驗。

1.2.3 建立大鼠原代星形膠質細胞培養(yǎng)體系 高純度的大鼠原代星形膠質細胞來源于出生24 h SD乳鼠大腦海馬組織，細胞分離、純化、種植程序與星形膠質細胞-神經(jīng)元共培養(yǎng)體系建立過程相同。不同的是細胞種植于含有10%的胎牛血清的DMEMF12培養(yǎng)基中，細胞懸液濃度與前述培養(yǎng)體系一致。種植1 h后更新全部細胞培養(yǎng)基以去除成纖維細胞，隨后每3～4天更新一半細胞培養(yǎng)基。在種植后的第4天，培養(yǎng)基中加入1．5 mmol·L-1亮氨酸甲酯去除小膠質細胞。細胞需要經(jīng)過至少兩次消化后傳代，但需保持傳代前后細胞種植密度一致。培養(yǎng)3周后應用于后續(xù)實驗。

1.2.4 細胞純度鑒定 利用免疫熒光三標技術鑒定不同原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系的細胞純度。各體系隨機選取細胞爬片5張，于24孔板中在室溫下通過4%的多聚甲醛（pH 7．4的PBS溶媒）固定30 min。用PBS溶解1%牛血清蛋白（BSA）+0．3%Triton X-100，在室溫下振蕩器上緩慢封阻非特異性結合并破膜1 h。PBS清洗15 min。用一抗稀釋液配制1∶1000神經(jīng)元抗核抗體（NeuN，兔源多克隆抗體，Ab-cam公司，美國）和 （或）1∶500膠質纖維酸性蛋白（GFAP，小鼠源單克隆抗體，CST公司，美國），每孔中加入約500 μL，4℃緩慢振蕩器孵育過夜。PBS清洗15 min。用PBS配制熒光二抗1∶100 FITC（康為世紀，北京）和1∶100異硫氰酸羅丹明（TRITC，康為世紀，北京），室溫下緩慢振蕩器孵育2 h。PBS清洗15 min。再次室溫下避光孵育，PBS配制1∶2000的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）10 min。PBS清洗15 min后將細胞爬片蓋于載玻片上，60%甘油PBS封片，熒光顯微鏡 （尼康Ti-S，日本）下觀察并進行圖像采集。FITC激發(fā)/發(fā)射波長480 nm/535 nm，TRITC激發(fā)/發(fā)射波長535 nm/610 nm。

利用Images J軟件進行圖像分析，每組細胞選擇10個不同的400倍視野計數(shù)不同熒光著染細胞數(shù)，取其平均值計算細胞比例。

1.2.5 細胞分組 各原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系分別隨機分為對照組（Control group）：始終進行正常培養(yǎng)；放射損傷組（X-ray group）：通過X線照射造成細胞放射性損傷；放射性損傷+依達拉奉組（X-ray+EDA group）：細胞接受X線照射后給予依達拉奉干預處理。

1.2.6 細胞放射性損傷[7]采用Varian 2100C型直線加速器，劑量率4 Gy·min-1的6 MV X射線造成細胞放射性損傷。射線從細胞貼壁面垂直入射，并加墊1．0 cm厚有機玻璃板，照射總劑量為30 Gy。照射完畢后繼續(xù)正常培養(yǎng)，72 h后繼續(xù)后續(xù)實驗。

1.2.7 依達拉奉干預處理[4]細胞照射接受X射線照射后，在培養(yǎng)基中加入100 mol·L-1依達拉奉進行干預處理，繼續(xù)正常培養(yǎng)，72 h后繼續(xù)后續(xù)實驗。

1.2.8 細胞死亡率測定 利用細胞存活/死亡熒光分析試劑盒（英國Invitrolife公司）對比檢測細胞死亡率。該試劑盒通過乙啡啶同源二聚體著染死亡細胞核DNA在528 nm激發(fā)波長下顯示紅色熒光，通過鈣黃綠素-AM著染細胞質在494 nm激發(fā)波長下顯示綠色熒光。按照說明書將試劑稀釋后加入細胞爬片所在的24孔板內，每孔中加入約500 μL，室溫下避光孵育30 min。然后將細胞爬片蓋于載玻片上，60%甘油PBS封片，熒光顯微鏡（尼康Ti-S，日本）下觀察并進行圖像采集。

利用Images J軟件進行圖像分析，每組細胞選擇10個不同的200倍視野計數(shù)不同熒光著染細胞數(shù)，取其平均值，計算細胞死亡率。

1.2.9 細胞凋亡檢測 利用NeuN/DAPI免疫熒光雙標在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，并計算凋亡率。各組細胞爬片在24孔板中室溫4%的多聚甲醛固定30 min，PBS清洗15 min。室溫下避光孵育，PBS配制1∶2000的DAPI 10 min。熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞形態(tài)。

1.2.10 ROS檢測[10]采用雙乙酸雙氯雙氫熒光素（CM-H2DCF-DA）法檢測接種于培養(yǎng)皿上的各組原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系的ROS含量。各原代培養(yǎng)體系的不同組細胞分別制作單細胞懸液，每個樣品收集10×103個細胞。檢測2′，7′-二氯熒光素（DCF）熒光強度，間接測定細胞內活性氧水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

本研究數(shù)據(jù)資料采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示。不同組樣本均數(shù)間的兩兩比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。根據(jù)各組總體方差齊同與否，選擇Bonferroni法或Tamhane's T2法修正結果，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系細胞純度測定（見圖1，見表1）

體外培養(yǎng)3周后，利用GFAP/NeuN/DAPI免疫熒光三標技術鑒定不同原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系細胞純度。來源于胎鼠海馬組織的原代星形膠質細胞-神經(jīng)元共培養(yǎng)體系中神經(jīng)元比例＞50%，星形膠質細胞比例＞45%；同樣來源于胎鼠海馬組織的原代神經(jīng)元培養(yǎng)體系中，神經(jīng)元純度＞80%；來源于乳鼠海馬組織的原代星形膠質細胞培養(yǎng)體系中，星形膠質細胞純度＞95%。各培養(yǎng)體系細胞形態(tài)正常，生長狀態(tài)良好，符合進一步實驗要求。

圖1 各原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系免疫熒光染色結果（200×）

表1 各原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系細胞純度測定結果（%）

2.2 各原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系細胞死亡率檢測（見圖2，見表2）

各原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系分別隨機分為對照組、放射損傷組、放射損傷+依達拉奉組以后進行相應處理，隨后利用細胞存活/死亡熒光分析試劑盒對比檢測細胞死亡率。如圖2所示，紅色熒光顯示為死亡細胞核，而綠色熒光顯示為正常存活細胞胞體。各培養(yǎng)體系對照組細胞死亡率均不超過20%。體系內比較，共培養(yǎng)體系經(jīng)過放射線照射后，細胞死亡率升高達到32.0%±4.0%。經(jīng)過依達拉奉干預治療后，細胞死亡率迅速恢復至17.0%±1.8%，達到正常水平，放射損傷組與其它兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；單純神經(jīng)元的放射性損傷甚為明顯，細胞死亡率明顯升高至68.0%±5.2%。依達拉奉干預治療效果依舊明顯，細胞死亡率恢復至25.0%± 3.6%，基本達到正常水平。放射損傷組與其它兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；星形膠質細胞培養(yǎng)體系對放射線損傷不敏感，體系內不同組間細胞死亡率比較無明顯差異（P＞0.05）。體系間比較，細胞種植密度相同情況下，射線照射以后神經(jīng)元培養(yǎng)體系細胞死亡率明顯高于共培養(yǎng)體系及星形膠質細胞培養(yǎng)體系，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明神經(jīng)元培養(yǎng)體系對放射性損傷最為敏感。依達拉奉干預治療后各培養(yǎng)體系間細胞死亡率已無統(tǒng)計學差異，表明依達拉奉治療收到了良好效果。

圖2 各原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系細胞存活/死亡分析試劑盒檢測結果（200×）

表2 各原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系細胞死亡率測定結果（±s，%）

表2 各原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系細胞死亡率測定結果（±s，%）

注：*體系內與X-ray組比較，P＜0.05；#體系間與神經(jīng)元培養(yǎng)體系比較，P＜0.05。

培養(yǎng)體系Control X-ray X-ray+EDA星形膠質細胞-神經(jīng)元共培養(yǎng)體系15.0±1.5*32.0±4.0#17.0±1.8*神經(jīng)元培養(yǎng)體系16.0±4.1*68.0±5.2 25.0±3.6*星形膠質細胞培養(yǎng)體系8.0±3.6 12.0±4.2#10.0±6.7

2.3 神經(jīng)元培養(yǎng)體系細胞凋亡檢測（見圖3）

各原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系間的細胞存活/死亡熒光分析結果表明，放射線照射致傷的細胞以原代神經(jīng)元為主，星形膠質細胞對放射線損傷并不敏感。據(jù)此，利用NeuN/DAPI免疫熒光雙標技術，對比了正常培養(yǎng)及放射性損傷后72 h原代神經(jīng)元培養(yǎng)體系凋亡情況。結果表明，射線照射以后培養(yǎng)體系中64%的神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡情況，而正常培養(yǎng)狀態(tài)下凋亡率僅為6%。凋亡神經(jīng)元在顯微鏡下顯示為藍色高亮、固縮、不規(guī)則形狀及碎裂的異常細胞核形態(tài)。以上結果也表明，神經(jīng)元的放射性損傷是以異常凋亡為主要表現(xiàn)的。

圖3 原代神經(jīng)元培養(yǎng)體系凋亡檢測結果（400×）

2.4 各原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系ROS含量檢測（見表3）

表3 各原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系細胞ROS含量測定結果（±s）

表3 各原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系細胞ROS含量測定結果（±s）

注：*體系內與X-ray組比較，P＜0.05；#體系間與神經(jīng)元培養(yǎng)體系比較，P＜0.05。

培養(yǎng)體系Control X-ray X-ray+EDA星形膠質細胞-神經(jīng)元共培養(yǎng)體系42.6±7.2*79.8±10.4#46.5±8.1*神經(jīng)元培養(yǎng)體系38.9±10.3* 103.6±8.8 48.3±10.6*星形膠質細胞培養(yǎng)體系40.3±9.6 43.9±5.6#41.5±9.3

各原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系的對照組、放射損傷組、放射損傷+依達拉奉組細胞ROS含量變化趨勢與細胞死亡率變化趨勢相一致。如表3所示，體系內比較，共培養(yǎng)體系及神經(jīng)元培養(yǎng)體系經(jīng)過放射線照射后，細胞活性氧含量均有明顯升高，依達拉奉干預治療后恢復至正常水平，體系內放射損傷組與其它兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。星形膠質細胞培養(yǎng)體系經(jīng)過不同處理后活性氧含量無明顯差異（P＞0.05）。體系間比較，僅放射性損傷組體系間有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），神經(jīng)元培養(yǎng)體系ROS含量高于其它兩種培養(yǎng)體系。其余兩組細胞體系間無明顯差異。

3 討 論

3.1 放射性腦損傷機制

放射治療已成為頭頸部腫瘤及血管病變的重要治療手段；但射線造成的放射性腦損傷也成為限制放療劑量、影響療效的重要因素[11]。目前放射性腦損傷發(fā)病機制主要包括：①血管損傷：主要發(fā)生在小血管和中等血管，以動脈為主，血腦屏障因而遭到破壞，最終導致腦缺血性梗死及毛細血管擴張癥[12]；②膠質損傷：放射性損傷后星形膠質細胞反應性肥大、增生，少突膠質細胞損傷甚為明顯，導致神經(jīng)髓磷脂代謝紊亂、嚴重者出現(xiàn)凝固壞死和白質空腔形成[13]；③自身免疫損傷：照射后神經(jīng)膠質細胞釋放抗原，引起過敏反應，同樣導致血管損傷和閉塞，進一步導致?lián)p傷區(qū)域凝固性壞死和白質廣泛脫髓鞘改變；④海馬、小腦及皮質的神經(jīng)干細胞損傷；⑤細胞因子表達異常[14]。

3.2 原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系對放射性損傷敏感性及與ROS含量變化關系

本研究重點關注了體外培養(yǎng)狀態(tài)下，神經(jīng)元及星形膠質細胞對放射損傷的敏感性差異及與細胞ROS含量變化關系。實驗結果表明，單純神經(jīng)元對放射性損傷最為敏感，星形膠質細胞-神經(jīng)元共培養(yǎng)體系敏感性明顯降低，單純星形膠質細胞則對放射損傷不敏感。細胞死亡以神經(jīng)元凋亡為主要表現(xiàn)形式。細胞ROS含量可以間接反映細胞氧化性損傷程度。檢測結果表明，各組細胞ROS含量差異與上述放射性損傷敏感性變化趨勢一致，說明氧化應激損傷是細胞放射性損傷的重要原因之一。ROS是一類分子的集合體，生理狀況下作為細胞內氧化還原信使，傳遞調控胞內信號，其生成和清除保持著動態(tài)平衡。應激狀態(tài)將打破這一平衡。具體導致?lián)p傷機制涉及多條信號轉導通路，包括活化死亡受體通路、線粒體凋亡通路、c-Jun氨基末端激酶（c-Junterminal kinase，JNK）介導的凋亡信號通路以及破壞細胞內谷胱甘肽相關的氧化還原平衡等，最終都將引起細胞凋亡失調[15]。

3.3 共培養(yǎng)體系中星形膠質細胞對神經(jīng)元的保護作用

本研究結果表明，共培養(yǎng)狀態(tài)下神經(jīng)元死亡率較單純神經(jīng)元培養(yǎng)有明顯降低。這表明共培養(yǎng)體系中星形膠質細胞的存在可能對神經(jīng)元產生了部分保護作用，從而降低了其對放射線的敏感性。我們推測這一保護作用的機制是星形膠質細胞緩解了射線照射后血管損傷引起的腦能量代謝障礙。研究表明，膠質細胞與神經(jīng)元之間相互作用貫穿于大腦發(fā)育和功能的各個方面，其中首當其沖的就是腦的能量代謝[16]。星形膠質細胞-神經(jīng)元乳酸穿梭假說（astrocyte-neuron lactate shuttle hypothesis，ANLSH）的提出，賦予了星形膠質細胞應激狀態(tài)下作為神經(jīng)元能量來源的角色，這是大腦能量代謝特殊性的具體體現(xiàn)[17]，對于維護大腦自穩(wěn)態(tài)至關重要。ANLSH得以實現(xiàn)的主要載體是單羧酸轉運體，由此構成了應激狀況下星形膠質細胞對神經(jīng)元內生性保護作用的分子基礎[18]。

3.4 依達拉奉對神經(jīng)元放射性損傷的保護作用

本研究應用依達拉奉對放射損傷后原代神經(jīng)細胞進行干預治療，結果表明依達拉奉通過清除細胞內異常增多的ROS，減輕細胞損傷，逆轉凋亡失調，有效降低了神經(jīng)元的死亡率。近年來神經(jīng)細胞膜代謝研究中發(fā)現(xiàn)了自由基的毒害作用，自由基清除劑的神經(jīng)保護功能由此成為研究熱點。依達拉奉是一種新型的自由基清除劑，其神經(jīng)保護機制如下：①體內的依達拉奉陰離子與自由基的不配對電子配對，使自由基失去作用，阻斷了自由基連鎖反應[19]；②依達拉奉清除羥基基團，抑制黃嘌呤氧化酶和次黃嘌呤氧化酶的活性，刺激前列環(huán)素生成，減少白三烯產生，降低羥自由基的濃度[20]；③依達拉奉阻斷內質網(wǎng)應激相關蛋白的表達，對神經(jīng)元起到保護作用[21]；④依達拉奉提高超氧化物歧化酶活性，減少丙二醛產生，抑制脂質過氧化，減輕細胞氧化損傷[22]；⑤依達拉奉調控凋亡相關基因表達而產生凋亡抑制作用[23]；⑥依達拉奉抑制皮質神經(jīng)元線粒體孔的開放而減少細胞色素C的釋放，抑制由其觸發(fā)的凋亡程序[24]。

神經(jīng)系統(tǒng)放射性損傷是臨床放射治療常見的副損傷之一。如何有效地提高腫瘤對放療敏感性并盡可能降低副損傷效應是臨床治療中亟待解決的問題。自由基清除劑的應用為臨床提供了新的治療思路。另外，針對本研究中涉及的星形膠質細胞對神經(jīng)元保護作用的分子機制的深入研究，有助于從機體內源性保護機制方面探尋新的腦保護治療方案。

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Relationship between the Radiation Injury Sensitivity and the ROS Content in Rat Primary Neural Cell Cultures and the Neuroprotective Effects of Edaravone

GAO Chen1,TIAN Li-zhuang2,ZHU Wen-xia3,LIU Yu-hu1,WU Xin-du1,ZHAO Yu1,ZHAO Fu-gui1
1Department of Neurosurgery,AnNing Branch Hospital;2Department of Neurosurgery;3Department of Trau-matology,AnNing Branch Hospital,Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command,Lanzhou,Gan-su 730070,China

Objective:To study the relationship between the radiation injury sensitivity and the reactive oxygen species (ROS)content in rat primary neural cell cultures and the neuroprotective effects of edaravone.Methods:A single-dose x-ray exposure protocol was used in primary cultures of neurons, astrocytes,and astrocytes-neurons derived from rat hippocampus,with or without edaravone treatment.Cell death,apoptosis and the content of ROS were evaluated.Results:X-ray resulted in significantly raised cell death rate and ROS content in the neuronal cultures.However,the cells injury was lighter in the astrocyte-neuron co-cultures and not significant in the astrocyte cultures.Edaravone inhibits the cell death by eliminating ROS.Conclusion:The content of ROS in neuronal cultures increased significantly after the radiation injury,resulted in apoptosis imbalance of neurons.Edaravone prevents this pathological process by eliminating ROS and thus has a protective effect on neurons,the drug is worth clinical promotion.

Co-culture;Radiation injury;Reactive oxygen species;Edaravone;Neuroprotection

R964

A

1673-7806（2015）03-211-06

高晨，男，主治醫(yī)師，外科學博士，主要研究方向：顱腦損傷規(guī)范化診療 E-mail:gc2006418@163.com

2014-12-02

2015-03-10