朱曉娜，韓 琳

江蘇省徐州市兒童醫(yī)院藥劑科,徐州 221000

松花粉對(duì)甘油誘導(dǎo)大鼠急性腎衰竭的保護(hù)作用

朱曉娜，韓 琳

江蘇省徐州市兒童醫(yī)院藥劑科,徐州 221000

目的：研究松花粉對(duì)甘油誘發(fā)大鼠急性腎衰竭（acute renal failure，ARF）的保護(hù)作用及機(jī)制。方法：采用雙側(cè)后肢注射50%甘油溶液（10 mL·kg-1）誘發(fā)大鼠成急性腎衰竭模型，檢測(cè)大鼠血清肌酐（Scr）、血清尿素氮（BUN）的含量，腎組織中超氧化物歧化酶（SOD）的活性，谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）的含量，同時(shí)測(cè)定腎組織中一氧化氮（NO）的含量和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的活性；HE染色觀察腎病理組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：與空白組大鼠相比，模型組大鼠血清Scr和BUN的含量明顯上升，腎組織中SOD的活性和GSH的含量顯著降低，MDA的含量顯著升高；組織病理檢查發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎小管損傷明顯，腎皮質(zhì)細(xì)胞部分脫落，腎小球腫脹，間質(zhì)炎性侵潤(rùn)明顯。給予松花粉治療后，可顯著降低ARF大鼠血清Scr和BUN，升高腎組織中SOD的活性、GSH的含量，降低MDA的含量，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，松花粉可明顯降低腎組織中NO的含量和iNOS的活性，并顯著降低腎組織損傷。結(jié)論：松花粉對(duì)甘油致大鼠ARF具有治療作用，其作用機(jī)制可能與抑制iNOS的活性，降低體內(nèi)NO過(guò)多產(chǎn)生，降低NO相關(guān)的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程有關(guān)。

松花粉；急性腎衰竭；一氧化氮；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；氧化應(yīng)激

松花粉（pollen pini），藥名松黃，其成分穩(wěn)定、易被機(jī)體吸收利用，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、作用廣泛的中藥保健品?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，松花粉具有抗氧化、抗炎、保護(hù)肝臟以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等廣泛作用。本實(shí)驗(yàn)以甘油誘發(fā)大鼠急性腎衰竭為模型，研究松花粉對(duì)腎臟的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料

1.1 藥品和試劑

松花粉，由中國(guó)林科院松花粉開(kāi)發(fā)研究中心提供，采用5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配制成所需濃度的混懸液；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、總丙二醛（MDA）測(cè)試盒、谷胱甘肽（GSH）試劑盒、血清肌酐（Scr）測(cè)試盒、血清尿素氮（BUN）測(cè)試盒、一氧化氮（NO）測(cè)試盒、蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒，均購(gòu)置南京建成生物研究所；誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（i-NOS）ELISA試劑盒購(gòu)于上海西塘生物有限公司。

1.2 儀器

高速勻漿機(jī)（上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司）；751G-可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)（上海分析儀器廠）；IX71光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社）等。

1.3 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，體重180～230 g，徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證編號(hào)：SYXK（蘇）2010-0011。實(shí)驗(yàn)前自由飲食一周，適應(yīng)環(huán)境，室溫（23±2）℃，濕度50%±10%。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組

將大鼠隨機(jī)分為4組，分別為空白對(duì)照組、模型組、松花粉低劑量組（350 mg·kg-1）和松花粉高劑量組（700 mg·kg-1）；每組8只。

2.2 模型制備

開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí)，禁水不禁食24 h后，除空白對(duì)照組大鼠外，其他3組大鼠一次性后肢注射50%甘油10 mL·kg-1體重，制備腎衰竭模型，此后所有大鼠給足水食。除空白組、模型組外，其他2個(gè)治療組每天同一時(shí)間點(diǎn)分別給予松花粉350 mg·kg-1和700 mg· kg-1治療，連續(xù)給藥7 d。

2.3 樣本采集及生化指標(biāo)的測(cè)定

末次給藥3 h后，各組大鼠麻醉處死，于腹主動(dòng)脈取血，3000 r·min-1離心取血清，用于測(cè)定Scr和BUN的含量。取腎臟用于檢測(cè)SOD活性、iNOS、GSH、MDA、NO的含量，嚴(yán)格按照試劑盒規(guī)定的方法比色測(cè)定吸光度，按公式換算成SOD、iNOS的活性以及GSH、MDA、Scr、BUN和NO的濃度。

2.4 蘇木素-伊紅染色觀察腎組織的損傷

腎臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，乙醇脫水后用石蠟包埋，4 μm切片，HE染色，于顯微鏡下觀察組織病理改變。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié) 果

3.1 松花粉對(duì)大鼠血清Scr和BUN含量的影響

表1結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組血清肌酐和尿素氮顯著升高；與模型組比較，松花粉低劑量組（350 mg·kg-1）和松花粉高劑量組（700 mg·kg-1）血清肌酐的含量明顯降低，同時(shí)兩給藥組血清尿素氮的含量也明顯降低。

3.2 松花粉對(duì)大鼠腎SOD的活性、GSH和MDA含量的影響

表1結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠腎組織SOD的活性和GSH含量明顯降低，MDA含量明顯升高；與模型組相比，松花粉高劑量組（700 mg· kg-1）腎組織SOD的活性和GSH明顯提高，松花粉低劑量組 （350 mg·kg-1）GSH含量與模型組相比無(wú)顯著差異，松花粉低劑量組和高劑量組腎MDA含量顯著降低。

3.3 松花粉對(duì)大鼠腎iNOS活性和NO含量的影響

表1結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠腎組織iNOS的活性和NO的含量明顯升高；與模型組相比，松花粉低劑量組（350 mg·kg-1）和松花粉高劑量組（700 mg·kg-1）腎組織中iNOS的活性和NO的含量顯著降低。

表1 松花粉對(duì)大鼠Scr、BUN、SOD、GSH、MDA、iNOS和NO含量的影響（±s，n=8）

表1 松花粉對(duì)大鼠Scr、BUN、SOD、GSH、MDA、iNOS和NO含量的影響（±s，n=8）

注：與空白組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別劑量/ mg·kg-1Scr/ mmol·L-1BUN/ mmol·L-1SOD/ kU·g-1GSH/ mmol·g-1MDA/ mmol·g-1iNOS/ nmol·min-1·g-1NO/ μg·g-1空白組—26．12±2．33 9．69±0．65 193．56±1．36 6．83±0．14 0．85±0．18 0．47±0．06 9．83±0．15模型組—48．43±2．73**32．4±3．42**103．17±4．41**2．65±0．39**3．73±0．16**4．37±0．22**24．65±0．39**松花粉低劑量組350 34．22±2．11#24．82±3．32#146．47±3．72#3．21±0．36 2．35±0．23#1．78±0．23#16．23±0．42#松花粉高劑量組700 27．00±2．01##16．50±2．43##156．35±5．64##5．57±0．76#1．03±0．14##1．39±0．15##12．52±0．16##

3.4 HE染色

光鏡檢查發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管上皮細(xì)胞完整，腎小球及腎間質(zhì)未見(jiàn)明顯病理改變（圖1A）；模型組腎小管管腔明顯擴(kuò)張，上皮細(xì)胞刷狀緣消失，大量上皮細(xì)胞水腫、空泡變性、壞死，間質(zhì)炎性浸潤(rùn)（圖1B）；松花粉高劑量組腎小球體積基本正常，腎皮質(zhì)細(xì)胞排列較整齊（圖1C）。

4 討 論

研究報(bào)道[3]，甘油誘導(dǎo)的急性腎衰竭動(dòng)物中，都伴有機(jī)體內(nèi)部氧自由基水平升高、還原性酶活性降低的現(xiàn)象，同時(shí)大量氧自由基的產(chǎn)生與腎組織細(xì)胞大分子反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而破壞腎組織細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，破壞腎臟的正常生理功能[4-5]。

研究發(fā)現(xiàn)[6]，在急性腎衰竭病理狀態(tài)下，腎組織中NO的生成和釋放顯著增加。NO是由以L-精氨酸為底物在NOS的催化下生成的一種重要?dú)怏w信號(hào)小分子物質(zhì)。正常生理功能下，NO在腎臟的內(nèi)部血液和體液以及鈉鉀平衡中發(fā)揮重要作用；但NO的過(guò)量生成釋放與腎小管的損傷密切相關(guān)，破壞細(xì)胞蛋白和呼吸鏈，且一氧化氮過(guò)量產(chǎn)生的過(guò)氧亞硝酸根離子直接參與細(xì)胞內(nèi)部的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。Rubanyi等[7]研究發(fā)現(xiàn)，急性腎衰竭中，NO的生成釋放增加的同時(shí)，iNOS的表達(dá)也顯著上升，說(shuō)明iNOS及NO與腎組織急性衰竭的密切關(guān)系。

有文獻(xiàn)報(bào)道[8]，松花粉對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老動(dòng)物的腎組織損傷具有顯著的治療作用，且其療效與其抗炎、抗氧化等機(jī)制有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，松花粉高、低兩個(gè)劑量組可明顯降低甘油誘導(dǎo)的大鼠急性腎衰竭中血清肌酐和尿素氮的含量，說(shuō)明松花粉對(duì)甘油誘導(dǎo)的大鼠急性腎衰竭具有改善作用。松花粉組與模型組比較SOD的活性明顯升高，GSH的含量顯著升高，MDA的含量明顯降低，且松花粉給藥劑量對(duì)氧化應(yīng)激性腎損傷的保護(hù)作用呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，同時(shí)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，給予松花粉可顯著降低大鼠腎組織中iNOS的活性和NO的含量，組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，松花粉可明顯降低腎臟的損傷程度，保護(hù)腎小管和腎小球的正常生理功能，降低炎性侵潤(rùn)，顯示其對(duì)急性和亞急性腎臟疾病存在較為有效的治療作用和潛在的藥用價(jià)值。

圖1 松花粉對(duì)腎組織的保護(hù)作用

綜上所述，松花粉對(duì)甘油誘導(dǎo)的大鼠急性腎衰竭具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與松花粉抑制腎組織中iNOS的活性，降低一氧化氮含量，降低腎組織氧化應(yīng)激損傷，維持組織細(xì)胞正常生理功能有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究為臨床治療急性腎衰竭提供一定的理論依據(jù)。

[1]立 新，喻 陸．松花粉抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2004，32（2）：74-6.

[2]Lee KH,Kim AJ,Choi EM.Antioxidant and antiin-flammatory activity of pine pollen extract in vitro[J]. Phytother Res,2009,23(1):41-48.

[3]Chander V,Chopra K.Molsidomine,a nitric oxide donor and L-arginine protects against rhabdomyolysisinduced myoglobinuric acute renal failure[J].Biochim Biophys Acta,2005,1723:208-14.

[4]Mahieu S,Contini Mdel C,Gonzalez M，et al.Mela-tonin reduces oxidative damage induced by aluminium in rat kidney[J].Toxicol Leu,2009,190(1):9-15．

[5]Muraoka S.Miura T.Free radicals mediate cardiac toxicity induced by adriamycin[J].Yakugaku Zasshi, 2003,123(10):855-66．

[6]Valdivielso JM,Blantz RC.Acute renal failure:is ni-tricoxide the bad guy?[J].Antioxid Redox Signal,2002, 4(6):925-34.

[7]Rubanyi GM,Vanhoutte PM.Superoxide anions and hyperoxia inactivate endothelium-derived relaxing factor [J].Am J Physiol,1986,250(5 Pt 2):H822-7.

[8]李 斌，喻 陸，高德祿，等.松花粉對(duì)亞急性衰老小鼠模型腎功能的影響 [J].浙江臨床醫(yī)學(xué)，2009，11（11）：1129-31.

Protective Effects of Pollen Pini against Glycerol-induced Acute Renal Failure in Rats

ZHU Xiao-na,HAN Lin
Department of Pharmacy,Xuzhou Children’s Hospital of Jiangsu Province,Xuzhou 221000

Objective:To study the protective effect of pollen pini against acute renal failure(ARF) induced by glycerol and its underlying mechanisms in rats.Methods:The rats were intramuscularly injected with 50%glycerol (10 mL·kg-1)in each hind leg to establish kidney damage.After the pini treatment for seven days,the contents of serum creatinine (Scr)and urea nitrogen (BUN),the activities of superoxide dismutase (SOD),inducible nitric oxide synthase (iNOS)and the contents of glutathione(GSH), malondialdehyde (MDA)and NO in the kidney tissue were examined.Results:Compared the model group with the control group,the contents of Scr and BUN in serum,the contents of MDA and NO and the activities of iNOS in kidney tissue were increased,the activities of SOD and the content of GSH were decreased;and the sections showed that the kidney tissue damage was obvious with bigger glomerular volume,swelling and degeneration of endothelial cells and renal interstitial inflammatory cell infiltration. However,pollen pini dose-dependently exhibited significantly decreases contents of Scr and BUN in the plasma,reduced contents of MDA and NO,and decreased activities of iNOS in the kidney tissue,as well as increased activities of SOD and content of GSH in the kidney tissue.The damage decreased after the administration of pollen pini.Conclusion:The results indicated that pollen pini had a protective effect against glycerol-induced ARF in rats.It is considered that this protective effect may be related to its activities on inhibition of iNOS and the level of NO,and its free radical scavenging related to NO.

Pollen pini;Acute renal failure(ARF);NO;iNOS;Oxidative stress

R965.1

A

1673-7806（2015）03-232-03

朱曉娜，女，主管藥師 E-mail:zhuxn2014@163.com

*通訊作者韓琳，女，副主任藥師 E-mail:dollhl@126.com

2014-10-06

2015-03-26