鄭龍龍 ，朱玲云，宋春蓮，高利波，畢峻龍，徐 英

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.楚雄州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南楚雄 675000；3.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650031 )

云南省犬細(xì)小病毒VP2基因檢測(cè)分析

鄭龍龍1，朱玲云1，宋春蓮1，高利波1，畢峻龍2，徐 英3*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.楚雄州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南楚雄 675000；3.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650031 )

為了解云南省犬細(xì)小病毒VP2基因分子流行變異情況，對(duì)來(lái)源于云南省7個(gè)地級(jí)市13個(gè)犬細(xì)小病毒樣品進(jìn)行了VP2基因的擴(kuò)增和序列分析，并與相關(guān)參考序列進(jìn)行了遺傳進(jìn)化比對(duì)分析。結(jié)果表明，13個(gè)樣品中9個(gè)基因型為CPV-2a，3個(gè)基因型為CPV-2b，1個(gè)基因型為CPV-2。氨基酸序列變異主要集中在297位-518位氨基酸處，其中324位和440位氨基酸變異在犬細(xì)小病毒進(jìn)化過(guò)程中扮演著重要角色。遺傳進(jìn)化分析顯示10個(gè)樣品序列形成了一個(gè)相對(duì)于國(guó)內(nèi)外參考序列獨(dú)立的遺傳進(jìn)化分支，提示云南省犬細(xì)小病毒以CPV-2a 基因型流行為主。

犬細(xì)小病毒；VP2基因；基因型；遺傳進(jìn)化

犬細(xì)小病毒病(Canine parvovirus disease，CPVD)是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus disease，CPV)引起的一種急性、烈性傳染病，是當(dāng)前對(duì)犬類危害最大的傳染病之一。該病能夠引起犬類白細(xì)胞減少、劇烈嘔吐、出血性腸炎等多種癥狀。犬細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬成員，編碼2個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1和VP2)，其中VP2蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是保護(hù)性顆粒抗原。VP2蛋白中一些具有生物學(xué)意義的主要抗原位點(diǎn)的變異導(dǎo)致了病毒抗原特性和宿主范圍的改變。CPV-2于20世紀(jì)70年代后期被發(fā)現(xiàn)不久之后，CPV-2逐漸被新的抗原變異株CPV2-a和CPV2-b取代[1-3]。近年來(lái)，另外一種新的變異樣品序列CPV2-c被證實(shí)在歐美國(guó)家廣泛存在[4]，國(guó)內(nèi)學(xué)者于2010年發(fā)現(xiàn)并證實(shí)CPV-2C變異樣品序列也存在于我國(guó)[5-6]。隨著頻繁的貿(mào)易交流，犬細(xì)小病毒不斷出現(xiàn)新的變異樣品序列，流行病學(xué)呈現(xiàn)復(fù)雜態(tài)勢(shì)，導(dǎo)致免疫失敗現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，為犬細(xì)小病毒病的預(yù)防和控制帶來(lái)了很大困難。由于目前幾乎沒(méi)有關(guān)于犬細(xì)小病毒云南株流行樣品序列基因型的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)細(xì)小病毒云南分離株VP2基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化和氨基酸位點(diǎn)突變的分析，調(diào)查云南省犬細(xì)小病毒分子流行變異情況，為該病的防控提供一定的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 采自云南省不同地區(qū)發(fā)生疑似犬細(xì)小病毒犬場(chǎng)及寵物醫(yī)院病犬糞便,樣品相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 樣品相關(guān)信息Table 1 Related information of sample gene sequence

1.1.2 主要試劑 DNA聚合酶、pMDTM18-T載體、限制性內(nèi)切酶BsrⅠ、HindⅢ等分子生物學(xué)試劑為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；其他試劑由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 儀器設(shè)備 移液器、超凈工作臺(tái)、高速冷凍離心機(jī)、恒溫水浴鍋、PCR儀、電泳槽、凝膠電泳成像儀等設(shè)備由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 VP2序列全長(zhǎng)1 755 bp，編碼584個(gè)氨基酸，參考 GenBank中犬細(xì)小病毒VP2基因參考序列，即M19296、M24003、EU659121、GU569947和GU569948等序列，應(yīng)用Oligo6.0軟件，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增CPV VP2基因的一對(duì)引物其中上游引物：5′-ACC ATG TAG ACT AAC ACA TAC-3′，下游引物：5′-ACA TAT TAG CAG CAT CAG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為741 bp。

1.2.2 VP2片段的擴(kuò)增及克隆 使用DNA提取試劑盒提取組織樣品總DNA，根據(jù)PCR試劑說(shuō)明書優(yōu)化反應(yīng)體系及條件，其中10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 1 μL，上游和下游引物分別0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，模板1 μL，加水補(bǔ)足25 μL。進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物和上樣緩沖液混合后，用15 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，20 min后觀察結(jié)果。 將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后與pMD18-T Vector進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌株后，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.3 序列測(cè)定與分析 將鑒定為陽(yáng)性的菌種進(jìn)行測(cè)序分析，使用DNA Star和MEGA 4.0等生物學(xué)軟件分別對(duì)所獲得基因序列進(jìn)行位點(diǎn)突變和遺傳進(jìn)化分析，并與國(guó)內(nèi)外參考序列進(jìn)行比較并繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)(表2)。

表2 分析所用的CPV參考序列及其來(lái)源Table 2 CPV strains used in this study and their origins

2 結(jié)果

2.1 VP2基因的擴(kuò)增與分析

樣品DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，經(jīng)15 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察后，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照及樣品均在DNA Maker DL 700 bp附近處有一條帶，與預(yù)期741 bp相符(圖1)。

圖1 VP2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR results of VP2 gene

2.2 VP2基因重組質(zhì)粒酶切鑒定

通過(guò)DNA Star 6.0分析，在pMDTM18-T載體上選擇HindⅢ，在目的片段第572位選擇BsrⅠ進(jìn)行雙酶切，預(yù)期目的片段為2 834 bp和599 bp或3 237 bp和196 bp。將切膠回收純化的CPV VP2基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(741 bp)，連接、轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)HindⅢ和BsrⅠ雙酶切后得到兩個(gè)大小約為2 834 bp和599 bp的片段，酶切結(jié)果與預(yù)期相符，表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒(圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmids digested with BsrⅠ and HindⅢ

2.3 VP2序列測(cè)定與分析

測(cè)序結(jié)果顯示，本試驗(yàn)獲得的13個(gè)VP2基因包含著741個(gè)堿基，編碼247個(gè)氨基酸。對(duì)所獲得的基因序列使用生物學(xué)軟件DNA Star與其他參考序列進(jìn)行核苷酸同源分析(表3)。結(jié)果表明，于2012年獲得的5株VP2基因的核苷酸同源性為99.5%～100%；于2013年獲得的8株VP2基因的核苷酸同源性為96.8%～100%；2012年序列和2013年樣品序列P2基因的核苷酸同源性98.8%～99.2%；2012序列與參考序列的核苷酸同源性為98.7%～99.5%，與疫苗序列EF112447核苷酸同源性為98.5%～98.8%；2013年序列與參考序列的核苷酸同源性為98.8%～99.75%，與疫苗序列EF112447核苷酸同源性為98.7%～99.6%。與2012年獲得的5株VP2基因的蛋白同源性為99.6%～100%；與2013年獲得的8株VP2基因的蛋白同源性為97.2%～100%；2012年序列和2013年序列VP2基因的蛋白同源性為98.8%～99.2%；2012年序列與參考序列的蛋白同源性為97.6%～99.2%，與疫苗序列EF112447蛋白同源性為97.2%～97.6%。2013年序列與參考序列的蛋白同源性為97.2%～100%，與疫苗EF112447蛋白同源性為96.8%～99.2%。

2.4 VP2基因氨基酸突變分析

將實(shí)驗(yàn)獲得的13個(gè)VP2氨基酸序列和部分歐美、亞洲及我國(guó)樣品序列的相應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行比較(表4)。云南VP2氨基酸序列變異主要集中在297位～518位氨基酸處，其中297、300、305、324、375、386、426、427、440和518位點(diǎn)存在氨基酸替換。2012YN-1、2012YN-2、2012YN-3、2012YN-4、2012YN-5、2013YN-6、2013YN-10、2013YN-11、2013YN-12為CPV-2a型，2013YN-7株為CPV2型，2013YN-8和2013YN-9株為CPV-2b型，CPV-2a型是云南省2012年-2013年的主要流行序列。

2.5 VP2基因遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

將所得到的13個(gè)2012年-2013年云南流行序列VP2基因與參考序列進(jìn)行遺傳分析后繪制進(jìn)化樹(shù)，如圖3所示。本試驗(yàn)所得病毒序列2013YN-7、2013YN-8和2013YN-9序列和其他云南毒株序列親源關(guān)系較遠(yuǎn)；2012YN-1、2012YN-2、2012YN-3、2012YN-4、2012YN-5 2013YN-6、2013YN-10、2013YN-11、2013YN-12、2013YN-13相對(duì)于其他參考序列形成了一個(gè)獨(dú)立分支。

表3 不同序列VP2序列氨基酸同源性Table 3 Sequence similarities of vp2 gene from difficult strains on nucleotide acid and amino acid levels %

表4 VP2基因片段中發(fā)生置換的氨基酸Table 4 The substitutions of the amino acids in the VP2 gene

圖3 CPV VP2基因遺傳進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic relationship of CPV VP2 gene

3 討論

VP2基因全長(zhǎng)1 755 bp，編碼584個(gè)氨基酸，它的關(guān)鍵位點(diǎn)的變異決定著犬細(xì)小病毒基因型。CPV-2a和CPV-2b 基因型序列VP2蛋白的在87、300、305位點(diǎn)氨基酸與CPV-2基因型不同[7]。CPV-2a和CPV-2b序列只在VP2基因的第426位氨基酸不同，其中426位點(diǎn)Asp是CPV-2b型序列特有的。在CPV-2a、CPV-2b基因型的基礎(chǔ)上，VP2蛋白的第300位點(diǎn)發(fā)生了G-D替換，由此產(chǎn)生了CPV-2c(a)和CPV-2c(b)兩個(gè)新的突變基因型[8]，因此，本研究擴(kuò)增的741 bp VP2基因片段主要包括了決定犬細(xì)小病毒基因型的關(guān)鍵位點(diǎn)，可以根據(jù)位點(diǎn)的變異來(lái)判斷云南流行株的基因型。

盡管CPV廣泛存在于世界，它的基因型在不同的國(guó)家和地區(qū)具有很大差異。近年來(lái)，在歐洲的許多國(guó)家，如英國(guó)、德國(guó)和意大利，CPV-2b型 和 CPV-2c型逐漸超過(guò)CPV-2a型，成為CPV優(yōu)勢(shì)流行基因型；CPV-2b型和 CPV-2c型在北美地區(qū)同許多歐洲國(guó)家一樣是CPV的優(yōu)勢(shì)基因型；而在南美，以CPV-2c型為CPV主要流行基因型[9-10]。CPV-2a是亞洲和澳大利亞的CPV主要優(yōu)勢(shì)基因型[11-13]。Zhang R等[14-15]通過(guò)分析2006年-2009年的CPV序列，證明我國(guó)CPV主要流行CPV-2a基因型。將云南13個(gè)CPV VP2的氨基酸序列使用生物學(xué)軟件進(jìn)行氨基酸位點(diǎn)變異分析后，結(jié)果表明2012YN-1、2012YN-2、2012YN-3、2012YN-4、2012YN-5、2013YN-6、2013YN-10、2013YN-11、2013YN-12基因型為CPV2a，2013YN-7基因型為CPV2，2013YN-8和2013YN-9基因型是CPV2b，CPV-2a

流行程度超過(guò)CPV-2b，是當(dāng)前云南省CPV主要流行基因型。本試驗(yàn)所獲得的VP2氨基酸序列變異主要集中在VP2基因297位～518位氨基酸處，其中97、300、305、324、375、386、426、427、440、518位點(diǎn)存在氨基酸替換，2012YN-1、2012YN-2、2012YN-3、2012YN-4、2012YN-5、2013YN-6、2013YN-10、2013YN-11、2013YN-12、2013YN-13的324位氨基酸由Tyr變成Ile位點(diǎn)，同324位點(diǎn)臨近的323位點(diǎn)對(duì)病毒具有重要的生物意義，該位點(diǎn)影響著病毒和犬運(yùn)載蛋白受體的結(jié)合及感染宿主的范圍[16]，2012YN-1、2012YN-3、2013YN-6、2013YN-11、2013YN-12、2013YN-13的440氨基酸位點(diǎn)由Thr變成Ala，相關(guān)研究表明了該位點(diǎn)在細(xì)小病毒進(jìn)化過(guò)程中扮演著重要角色。所得到的13個(gè)2012年-2013年云南流行VP2基因序列與國(guó)內(nèi)外VP2參考序列繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，云南流行毒2013YN-9和2013YN-8樣品序列和其他云南毒親源關(guān)系較遠(yuǎn)，2012YN-1、2012YN-2、2012YN-3、2012YN-4、2012YN-5、2013YN-6、2013YN-10、2013YN-11、2013YN-12、2013YN-13形成了一個(gè)獨(dú)立分支，提示：犬細(xì)小病毒云南流行基因型在云南本地的流行過(guò)程中形成了相對(duì)獨(dú)立于其他參考序列的云南分支。

本研究通過(guò)對(duì)云南省犬細(xì)小病毒序列進(jìn)行基因型和遺傳進(jìn)行分析，表明了當(dāng)前云南省流行的病毒基因型主要有 CPV-2a、CPV-2b和CPV-2，其中以CPV-2a占主要地位，初步了解云南省犬細(xì)小病毒VP2基因序列遺傳進(jìn)化趨勢(shì)，為該病的預(yù)防和控制提供了一定的理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

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Detection and Analysis of VP2 Gene of Canine Parvovirus in Yunnan Province

ZHENG Long-long1,ZHU Ling-yun1,SONG Chun-lian1,GAO Li-bo1,BI Jun-long2,XU Ying3

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan,650201,China; 2.ChuxiongProvinceCenterforDiseaseControlandPrevention,Chuxiong,Yunnan,675000,China; 3.YunnanVocationalandTechnicalCollegeofAgriculture,Kunming,Yunnan,650031,China)

In order to investigate the prevalence and variation of VP2 gene of CPV in Yunnan province, the gene amplification and sequence analysis were performed for thirteen strains of canine parvovirus, comprising of 9 strains of CPV-2a, 3 strains of CPV-2b and 1 strain of CPV-2. It was shown that most of the amino acid variations occurred within the region of position 297-518. A high level of substitution at 324 and 440 sites was associated with the evolution of antigenic variants in circulating parvovirus types. Based on the phylogenetic analysis on the amino acid level of the VP2 proteins, the thirteen strains of CPVs were grouped into 3 clusters. Nine of them belonged to CPV-2a, three belonged to CPV-2b, and one belonged to CPV-2. The result showed that CPV-2a was the main prevalent strain in Yunnan province and formed the independent branch.

Canine parvovirus;VP2 gene;typing;genetic evolution

2014-09-28

云南省公益性關(guān)鍵技術(shù)研究開(kāi)發(fā)計(jì)劃子項(xiàng)目(2013CH001)

鄭龍龍(1988-)，男，山西運(yùn)城人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病學(xué)與分子流行病學(xué)研究。*

S852.659.2

:A

:1007-5038(2015)01-0066-05