法凱綜述 孫濤審校

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胃癌干細胞的研究進展

法凱綜述 孫濤審校

胃癌干細胞；分子標志物；信號轉(zhuǎn)導途徑

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.01.031

腫瘤干細胞(cancerstemcell，CSC)是腫瘤細胞中存在著的一小群具有自我更新能力、能夠分化成不同表型的腫瘤細胞[1]，使腫瘤在體內(nèi)不斷擴大或形成新的腫瘤細胞，在腫瘤的形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移方面起著重要的作用。CSC的自我更新表現(xiàn)為細胞對稱分裂和不對稱分裂2種方式，如以對稱分裂為主，則其總量迅速擴增，所有細胞形態(tài)相似。發(fā)生不對稱分裂時，分化性腫瘤細胞無自我更新能力，每次細胞分裂產(chǎn)生的子代細胞進一步分化，導致其比親代細胞更為成熟，形態(tài)表型更為多樣[2]。CSC在分化過程中經(jīng)歷以下階段：CSC、腫瘤前體細胞(progenitorcell，PC)、快速擴增細胞(rapidlyproliferatingcell)、終末分化細胞(成熟細胞)(terminallydifferentiatedcel1)[3]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復雜的過程，包括腫瘤細胞從原發(fā)灶中脫落侵入循環(huán)系統(tǒng)、經(jīng)血管內(nèi)皮細胞遷移、組織浸潤、自我更新、增殖分化及誘導血管生成，最終只有0.01%或更少的腫瘤細胞可以發(fā)展為轉(zhuǎn)移瘤。本文現(xiàn)將有關(guān)胃癌干細胞的研究進展綜述如下。

1 胃癌干細胞的來源

1.1 胃干細胞的累積性突變Karam等[4]研究表明在三葉肽因子1(trefoilfactor1，TFF1)基因敲除的小鼠中，胃腺腔中PC增多，這些細胞擁有干細胞特性，可導致胃癌的發(fā)生。早在20世紀90年代已被發(fā)現(xiàn)用N-甲基-N-亞硝基脲染色的C3H/HeN-BALB/c嵌合小鼠中的胃癌細胞是由同一親本類型細胞組成。以上實驗均支持了胃癌起源于干細胞的觀點。

1.2 骨髓源性干細胞(bone-marrowderivedstemcell，BMDC)BMDC也可能是胃癌細胞來源之一。在對H.Felis/C57BL/6小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，對其進行致死量放療后，輸入表達β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓，用半乳糖苷酶染色來追蹤骨髓細胞。發(fā)現(xiàn)在感染HP后，BMDC會重新會聚到胃黏膜處，長期觀察發(fā)現(xiàn)，胃黏膜將發(fā)生腸化生、不典型增生和癌變。定植的BMDC既表達BMDC分子標志物，又表達胃腺體上皮標志物，其機制可能是慢性炎性反應(yīng)時胃中細胞因子對BMDC具有誘導作用。同時，他們還證明了多表型的BMDC并非是與胃上皮細胞融合后形成。值得注意的是，在HP急性感染或者其他的胃黏膜急性損傷時，并未見BMDC定植于胃黏膜，只有在慢性感染時才觀察到BMDC對胃黏膜的修復。但慢性炎性反應(yīng)與BMDC間的關(guān)系還需進一步研究。

2 胃癌干細胞分子標志物

2.1VillinVillin是一種在腸細胞毛刷邊緣包裹肌動蛋白細肌絲的結(jié)構(gòu)蛋白，在腸上皮細胞、卵黃囊細胞、腎近端小管細胞高水平表達。Qiao等[8]發(fā)現(xiàn)被β-半乳糖苷酶cDNA標記的Villin等位基因在成體胃中表達時僅限于1個稀少的亞群，這個亞群被稱為V-GPC(Villinpromoter-markedgastricprogenitorcells)。V-GPC長期存活并且高度靜息，它能補充多系細胞，其特性與干細胞極其相似。在成熟腺體中，單個V-GPC在10%的腺體中被發(fā)現(xiàn), 其中大部分在胃小彎，少部分在胃體和在毗鄰于鱗狀—柱狀細胞交界處。具有干細胞特性的V-GPC在炎性環(huán)境中就會進入細胞周期，首先集中對稱分裂以自我更新，然后不對稱分裂補充所有腺體細胞。而Villin則可作為胃干細胞及胃CSC的標志物之一。

2.2 富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯(lián)受體5(leucine-richGprotein-coupledreceptor5,Lgr5)Lgr5是另一種可能的CSC標志物[9]，最早在結(jié)腸癌中作為Wnt信號途徑的靶基因被發(fā)現(xiàn)。與V-GPC相似，Lgr5+細胞(L-GPC)集中于胃癌高發(fā)區(qū)域，即胃竇小彎處。但是L-GPC與靜息的V-GPC不同，它能迅速增殖。系譜追蹤研究已經(jīng)證明L-GPC能產(chǎn)生胃腺體的所有細胞。L-GPC與腸Lgr5+細胞類似，表達Wnt靶基因，例如高水平表達Axin2，這提示它們受Wnt信號途徑調(diào)節(jié)。利用這個發(fā)現(xiàn)，還觀察到L-GPC在APCmin鼠模型(Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑已激活)中能誘導胃腫瘤產(chǎn)生。最近，Simon等[10]在試驗中發(fā)現(xiàn)：Lgr5+在胃腫瘤中與其他CSC標志物如Mist1、CD44等共表達。上述研究表明：胃腫瘤可來自于L-GPC，Lgr5+亦可作為CSC標志物。

2.3Trefoil因子家族2(Tff2)Tff2是包含三葉草結(jié)構(gòu)模體的小肽，通常在胃黏膜修復調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，因為Tff2在假性幽門化生或TFF2表達譜系(spasmolyticpolypeptide-expressingmetaplasia，SPEM)中高度上調(diào)，所以它通常用作化生改變的標志物。在正常胃組織，Tff2mRNA(非蛋白質(zhì))在峽部增殖區(qū)域表達，表明Tff2 可作為胃祖細胞的識別標志物[10]。

2.4Mist1/Bhlha15Mist1是胃腸道外分泌細胞的分泌顆粒形成和成熟的必需因子,可通過直接激活編碼小GTP酶的RAB26和RAB3D基因，在轉(zhuǎn)化因子XBP1協(xié)調(diào)下誘導細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生，從而調(diào)節(jié)外分泌顆粒的結(jié)構(gòu)改變和成熟[11]。Mist1的表達始于頸黏液細胞向成熟主細胞的轉(zhuǎn)變。Nam等[12]的實驗表明：Mist1-Cre-ERT2小鼠(包含CreERT的Mist1等位基因)只在主細胞中才發(fā)現(xiàn)LacZ有極強活性。這證明了Mist1是主細胞標志物。但是，在給予三苯氧胺后10d再給予SPEM誘導劑DMP-777，將會在腺體基底出現(xiàn)Tff-2陽性SPEM細胞系，并且LacZ染色陽性(即Mist1細胞)。MerckL-635是另一種與DMP-777結(jié)構(gòu)相關(guān)的毒性物質(zhì)，它能在炎性環(huán)境中導致壁細胞丟失，并產(chǎn)生SPEM細胞。MerckL-635誘導SPEM比DMP-777更快, 但是和DMP-777一樣，在系譜追蹤中，它誘導的化生細胞既是Tff2陽性細胞又是LacZ陽性細胞(即Mist1細胞)。這些細胞同時也是Ki67陽性細胞，這就提示成熟主細胞已經(jīng)增殖擴增，并產(chǎn)生SPEM細胞。上述實驗表明：在壁細胞缺失時主細胞能變成SPEM的PC，且Mist1仍然陽性，而炎性反應(yīng)會加速這一過程。這提示Mist1也可能作為CSC或PC的標志物。同時，這也對研究化生細胞是如何進展為不典型增生細胞提供了思路。

2.5CD44CD44是富集于實體腫瘤原始細胞中的標志物。Takaishi等[13]檢測了幾種腫瘤細胞系，并發(fā)現(xiàn)CD44的表達能用于腫瘤起始細胞的分離。當CD44陽性與CD44陰性細胞從幾種胃癌細胞系中分離后，10%～20% 的CD44陽性細胞能在培養(yǎng)基中產(chǎn)生球形克隆，僅不到1%的CD44陰性細胞能產(chǎn)生。且隨著時間的推移，CD44陽性細胞能產(chǎn)生CD44陰性細胞。將CD44陽性細胞注射入SCID大鼠胃后，能高效率產(chǎn)生腫瘤。但是，迄今還沒有體內(nèi)CD44陽性細胞的系譜追蹤。且CD44陽性的腫瘤起始細胞與多種分化潛能的L-GPC和V-GPC亞群的關(guān)系還未被闡明。

2.6Doublecortin樣激酶1(Dclk1)Dclk1是在神經(jīng)細胞中發(fā)現(xiàn)并被認為在神經(jīng)遷徙中有重要作用。Dclk1很早就被提出是胃PC的標志物。曾有微陣列研究表明通過激光捕獲顯微切割，從胃腺體峽部獲得所需胃細胞。為了增加發(fā)現(xiàn)干細胞的機會，他們利用無菌小鼠表達H+/K+-ATP酶啟動子介導的減毒白喉毒素以殺死壁細胞，結(jié)果觀察到PC成簇擴增，并且發(fā)現(xiàn)Dclk1是該過程聚集的轉(zhuǎn)錄因子之一。May等[14]將Dclk1標記的細胞從胰腺分離，并在懸浮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果產(chǎn)生了球樣細胞團，當把這些細胞球注射入裸鼠腰部后又形成瘤結(jié)節(jié)。Zhao等[15]在胃上皮內(nèi)瘤變中發(fā)現(xiàn)了Dclk1細胞擴增。但目前仍沒被系譜追蹤研究證實Dclk1陽性細胞就是PC。

2.7Prominin-1(prom1)/CD133Prom1/CD133是一種起初作為造血干細胞的標志物子集而被發(fā)現(xiàn)的跨膜糖蛋白，但后來人們注意到它有更廣泛的表達。CD133已經(jīng)被認為是各種組織干細胞的標志物[16]。在胃癌中，幾乎50%的人腫瘤樣本是CD133陽性，且其活性與腫瘤進展有關(guān)[15，17]。在胃癌的蒙古沙鼠模型中，人們觀察到胃腺體被CD133細胞逐步侵蝕[18]。有實驗證明CD133標記了胃竇腺體的基底部，包括L-GPC群和生長在干細胞位置的細胞。通過修飾CD133 的等位基因，使它可以表達mCherry報告分子和CreERT2[19]，利用這個原理，對腸mCherry表達模型進行檢測，發(fā)現(xiàn)CD133標記了隱窩基底的柱狀細胞中的L-GPC和整個隱窩下半部分。也就是說CD133表達于干細胞和其短暫的放大子代。

3 胃癌干細胞相關(guān)信號轉(zhuǎn)導途徑

由于CSC的分離、純化、擴增尚未解決，現(xiàn)仍無確切的與CSC相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導途徑，但近年來對胃癌信號轉(zhuǎn)導途徑的研究為CSC轉(zhuǎn)導途徑的研究提供了思路和依據(jù)。以下是胃癌中研究最多的信號轉(zhuǎn)導途徑。

3.1Notch信號傳遞系統(tǒng)Notch是由Notch配體、Notch受體、Notch信號傳遞效應(yīng)分子組成。Notch信號轉(zhuǎn)導過程的特點是不需要第二信使和蛋白激酶的參與，就可直接接受臨近細胞的信號并傳到細胞核，激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，這種傳導方式并不能放大信號，但對于細胞分化起始過程的精確調(diào)控是十分必要的[20]。Notch與干細胞自我穩(wěn)定及胃腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。Kim等[21]實驗表明：Notch信號途徑在胃上皮成熟過程中出現(xiàn)，但成熟后則主要限制于成熟腺體峽部。實驗中，他們用遺傳及化學抑制的方法證明：Notch信號途徑可以維持干細胞室。在胃上皮細胞中，Notch信號途徑的激活能充分使上皮細胞去分化為干細胞或擁有所有主要細胞表型的多潛能PC并定植于黏膜。在去分化壁細胞中長期的Notch信號途徑激活會逐漸加強細胞增殖，誘導擁有Wnt信號的腺瘤產(chǎn)生。但是，正常胃上皮干細胞中Notch活躍并不影響細胞增殖。這些結(jié)果表明：在特定的細胞微環(huán)境中，Notch信號途徑可能存在于CSC并發(fā)揮作用。

3.2SonicHedgehog(Shh)信號傳導途徑 目前已知的Hedgehog信號通路包括Desert、Indian和Sonic3種，Shh信號通路在胃發(fā)育中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可通過抑制p14和p16，進而起到保護cyclinD/Cdk4和阻礙p53的作用[22]。Shh高度表達于成體胃，成體胃中Shh信號途徑被藥物抑制將會導致壁細胞丟失及腺體分化中斷。同時，Shh性壁細胞缺失大鼠模型提示：Shh控制著胃上皮細胞更新及壁細胞功能[23]。在腫瘤細胞球形培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)中，球形培養(yǎng)所得的腫瘤細胞具有干細胞樣特點，異體移植能產(chǎn)生腫瘤。同時，球形培養(yǎng)所得的干細胞樣腫瘤細胞中檢測到Shh信號活躍。這提示了Shh信號途徑在CSC中發(fā)揮著作用[24]。有研究發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌(Hp)相關(guān)胃癌中發(fā)現(xiàn)Shh產(chǎn)物的提高與胃腫瘤組織活檢陽性率呈正相關(guān)，也說明了Shh過度表達促進胃腫瘤形成。事實上，在幾個胃癌細胞系中，Shh信號途徑產(chǎn)物的表達已經(jīng)被證實。在早期Hp相關(guān)胃炎中，對萎縮和化生的形成來說，Shh的丟失是基本條件。

3.3Wnt信號傳導途徑Vermeulen等[25]認為Wnt信號途徑的激活是腸道腫瘤CSC的標志，說明Wnt對于腸型胃腫瘤有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路主要有3種：經(jīng)典Wnt信號通路、PCP途徑(planarcellpolaritypathway)即細胞極性通路、Wnt/Ca2+通路[26～29]。經(jīng)典信號途徑是上皮惡性轉(zhuǎn)變的主要貢獻者，大約85%的散發(fā)結(jié)腸癌有APC突變。APC突變導致GSK3β/Axin/APC復合體維持β-catenin穩(wěn)定，進一步導致了β-catenin/TCF/LEF復合體的聚集和靶基因的轉(zhuǎn)錄增強、細胞增殖[27,30]，最終導致腫瘤形成。

4 展 望

實驗證明，具有干細胞活性的腫瘤細胞(即可能的CSC)對化療有強烈的抵抗作用，也有極強的增殖活性，故對CSC的研究能為腫瘤的根治提供方向?，F(xiàn)在科學家探索各種方法研究CSC，例如懸浮球形集落模型、體內(nèi)成瘤實驗、系譜追蹤、側(cè)群細胞(SP)分析、乳斑篩選CSC等，并在CSC生物標志物、CSC確認等方面取得進展。未來的研究將會致力于胃CSC的確認和描述，并應(yīng)用于胃癌患者的診斷、治療和預后判斷。

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100048 北京，解放軍海軍總醫(yī)院消化內(nèi)科

孫濤，E-mail:drsuntao1@163.com

2014-09-18)