武犁 周蕓蕓 陳櫻

·臨床研究·

程序性細(xì)胞死亡因子4在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)及與臨床病理的關(guān)系研究

武犁 周蕓蕓 陳櫻

目的探討視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)組織中程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)的表達(dá)及其與臨床分期和組織分化的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)PDCD4在35例RB組織中的表達(dá)；用MPIAS-500彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量其平均積分光密度值。結(jié)果在35例RB組織切片中，均可見(jiàn)PDCD4的陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)水平明顯低于正常視網(wǎng)膜組織(P<0.05)；眼外擴(kuò)展期組PDCD4的表達(dá)水平明顯低于眼內(nèi)生長(zhǎng)期組和眼壓增高期組(P<0.05)；PDCD4 在RB的陽(yáng)性表達(dá)水平與腫瘤組織的分化程度及視神經(jīng)浸潤(rùn)顯著相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)DCD4蛋白表達(dá)水平與RB的臨床分期、視神經(jīng)浸潤(rùn)以及組織分化有關(guān)，PDCD4可作為判斷RB浸潤(rùn)及預(yù)后的指標(biāo)。(中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2015，15：403-405)

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；程序性細(xì)胞死亡因子4；免疫組織化學(xué)；組織分化

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)是一種起源于胚胎型視網(wǎng)膜細(xì)胞的惡性腫瘤，是嬰幼兒最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的眼內(nèi)惡性腫瘤，嚴(yán)重危害患兒視力甚至生命[1]。作為第1個(gè)分離出的人類抑癌基因，RB基因突變而導(dǎo)致的失活是RB發(fā)生的重要機(jī)制。程序性細(xì)胞死亡因子4 (programmed cell death 4，PDCD4) 作為近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，能夠通過(guò)抑制蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。有研究[2-5]提示：PDCD4 的表達(dá)水平可能與包括RB在內(nèi)的某些腫瘤的發(fā)生及惡性程度有關(guān)。我們采用免疫組織化學(xué)方法探討新抑癌基因PDCD4蛋白的表達(dá)與RB的臨床分期及組織分化的相關(guān)性，為RB的病情進(jìn)展及預(yù)后判斷提供理論依據(jù)，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 資料 經(jīng)臨床病理證實(shí)為RB且資料完整的RB患者35例，其中男性22例、女性13例；年齡9個(gè)月～12歲，平均 (3.8±1.6)歲。均為單眼發(fā)病，右眼15例、左眼20例。按照傳統(tǒng)臨床分期[6]，本組病例中，眼內(nèi)生長(zhǎng)期11例，眼壓增高期14例，眼外擴(kuò)展期10例。眼壓增高是通過(guò)非接觸式眼壓計(jì)或修氏眼壓計(jì)進(jìn)行測(cè)量。依據(jù)Stannard等[7]的分類方法，根據(jù)視神經(jīng)受侵犯程度來(lái)分，N0：視神經(jīng)未受侵襲；N1：腫瘤侵犯視乳頭，但局限于篩板內(nèi)；N2：腫瘤侵犯篩板后視神經(jīng)，但視神經(jīng)切除斷端未見(jiàn)腫瘤；N3：視神經(jīng)斷端可見(jiàn)腫瘤。本組病例中，N0期14例、N1期8例、N2期9例、N3期4例。按照蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin, HE)染色病理切片的表現(xiàn)來(lái)分，R0：腫瘤細(xì)胞不呈菊花團(tuán)排列(每高倍鏡視野內(nèi)菊花團(tuán)排列數(shù)<3個(gè))；R1：僅有少數(shù)腫瘤細(xì)胞呈菊花團(tuán)排列(每高倍鏡視野內(nèi)菊花團(tuán)排列數(shù)3～5個(gè))；R2：多數(shù)腫瘤細(xì)胞呈菊花團(tuán)排列(每高倍鏡視野菊花團(tuán)排列數(shù)>5個(gè))。本組病例中，R0 15例、R1 6例、R2 14例。所有RB患者的腫瘤組織均取自球內(nèi)。另取6例角膜移植供體眼視網(wǎng)膜組織作為對(duì)照，供體眼均為自愿捐獻(xiàn)者，無(wú)視網(wǎng)膜疾病史。

1.2 主要試劑 鼠抗人PDCD4多克隆抗體；免疫組織化學(xué)S-P試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(diamino benzidine, DAB)顯色劑及中性樹(shù)膠等均采購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 采用S-P法進(jìn)行染色，主要步驟如下：石蠟標(biāo)本行4.0 μm厚連續(xù)切片，脫蠟，梯度乙醇水化，30 g/L過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；微波修復(fù)抗原，磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)漂洗；滴加一抗，4 ℃濕盒過(guò)夜；漂洗后，滴加二抗工作液，37 ℃濕盒內(nèi)孵育30 min；洗滌后，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素，置濕盒內(nèi)，37 ℃孵育30 min；DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果；滿意后水洗終止，蘇木素襯染，梯度乙醇脫水，中性樹(shù)脂封片。PBS代替一抗做陰性對(duì)照。每個(gè)病例做5張切片，重復(fù)3次。利用MPIAS-500彩色病理圖像分析系統(tǒng)光學(xué)顯微鏡下觀察并測(cè)量PDCD4蛋白在正常視網(wǎng)膜和RB組織中的積分光密度，每張切片選取10 個(gè)視野。

2 結(jié)果

2.1 PDCD4蛋白表達(dá) 在35例RB組織切片中均可見(jiàn)PDCD4蛋白陽(yáng)性表達(dá) (圖1)，平均積分光密度值為0.197±0.014；6例正常視網(wǎng)膜組織中，PDCD4蛋白亦呈陽(yáng)性表達(dá)，平均積分光密度值為0.225±0.013，明顯高于RB組織，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2.2 PDCD4蛋白表達(dá)水平與臨床分期及視神經(jīng)浸潤(rùn)的關(guān)系 PDCD4蛋白表達(dá)在眼內(nèi)生長(zhǎng)期組、眼壓增高期組和眼外擴(kuò)展期組的積分光密度值分別為0.210±0.012、0.207±0.010和0.169±0.014。眼外擴(kuò)展期組明顯低于眼內(nèi)生長(zhǎng)期組和眼壓增高期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而眼內(nèi)生長(zhǎng)期和眼壓增高期組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1. PDCD4在RB組織中的陽(yáng)性表達(dá) SP×400

PDCD4 蛋白在N0期、N1期、N2期和N3期各組的積分光密度值分別為：0.214±0.012、0.207±0.013、0.187±0.011和0.178±0.009，PDCD4蛋白積分光密度值與腫瘤組織視神經(jīng)浸潤(rùn)相關(guān)(P<0.05)，視神經(jīng)浸潤(rùn)組PDCD4蛋白積分光密度值明顯低于視神經(jīng)無(wú)浸潤(rùn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。

2.3 PDCD4蛋白表達(dá)水平與病理組織分化的關(guān)系 35例RB中，不同分化型組織中PDCD4蛋白積分光密度值分別如下，R0： 0.182±0.011，R1:0.198±0.012，R2：0.224±0.011，PDCD4蛋白積分光密度值與腫瘤組織分化程度相關(guān)(P<0.05)，未分化組PDCD4蛋白積分光密度值明顯低于分化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

PDCD4是新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因之一，它定位于染色體10q24。PDCD4蛋白由 469個(gè)氨基酸組成，包含N末端結(jié)構(gòu)域、 C末端結(jié)構(gòu)域和2個(gè)保守的α螺旋MA-3結(jié)構(gòu)域[2]。雖然PDCD4基因在腫瘤發(fā)生中的詳細(xì)作用機(jī)制尚不清楚[2-3]，但是已有的研究顯示：PDCD4基因可能通過(guò)多種途徑參與細(xì)胞凋亡調(diào)控，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移作用。有研究[8-9]表明：PDCD4可能在轉(zhuǎn)錄、翻譯和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄阻遏基因EIF4A，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成，最終抑制了細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。另有研究[10-11]證明，PDCD4 mRNA水平在膠質(zhì)瘤中表達(dá)缺失率為47%，而蛋白表達(dá)的缺失率達(dá)到了77%，從而推測(cè)PDCD4在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)缺失應(yīng)該比較常見(jiàn)。還有研究[12]發(fā)現(xiàn)，PDCD4轉(zhuǎn)染可以抑制U251細(xì)胞的細(xì)胞增殖和克隆，并且影響了U251細(xì)胞系的細(xì)胞周期，使細(xì)胞周期停留在S期，從而抑制腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化。Shen等[5]的研究顯示：miR-21下調(diào)引起突變RB基因的表達(dá)，而PDCD4可能在這一過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，提示PDCD4可能與RB的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

有報(bào)道[13]稱,低表達(dá)的PDCD4 與胃癌的臨床分期進(jìn)展、組織浸潤(rùn)深度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。Ren 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-183的過(guò)表達(dá)可抑制PDCD4 的功能，從而導(dǎo)致食管鱗狀細(xì)胞癌的增殖和侵襲。我們的研究結(jié)果與此類似，發(fā)現(xiàn)：PDCD4蛋白在RB患者眼外擴(kuò)展期組表達(dá)明顯低于眼內(nèi)生長(zhǎng)期組和眼壓增高期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而眼內(nèi)生長(zhǎng)期和眼壓增高期組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，RB腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)視神經(jīng)組PDCD4蛋白表達(dá)量明顯低于未浸潤(rùn)組，表明PDCD4蛋白表達(dá)不僅與RB的臨床分期有關(guān)，而且與RB的視神經(jīng)浸潤(rùn)能力有關(guān)，即RB組織中PDCD4蛋白表達(dá)量越低，其浸潤(rùn)潛能越強(qiáng)，也就越易發(fā)生浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。

我們的觀察結(jié)果還顯示：RB組織中，PDCD4蛋白表達(dá)與組織分化程度有關(guān)，未分化型PDCD4蛋白的表達(dá)量明顯低于分化型。Tu等[15]也發(fā)現(xiàn)胃癌組織的PDCD4 蛋白表達(dá)與腫瘤的分化程度呈負(fù)相關(guān)，即高分化的胃癌表現(xiàn)為高表達(dá)PDCD4 蛋白，低分化的胃癌表現(xiàn)為低表達(dá)PDCD4 蛋白。以上結(jié)果說(shuō)明，細(xì)胞分化差和增殖能力強(qiáng)的腫瘤轉(zhuǎn)移潛能大，其預(yù)后會(huì)更差。因此，觀察RB組織中PDCD4蛋白的表達(dá)對(duì)了解RB的組織學(xué)特性也有重要的意義。

綜上所述，PDCD4蛋白表達(dá)與RB的臨床分期及組織分化具有重要的相關(guān)性，PDCD4可作為判斷RB的惡性程度、視神經(jīng)浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)，深入探討 PDCD4蛋白與RB的相關(guān)性對(duì)RB的治療與預(yù)后判斷具有重要的指導(dǎo)意義。

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(本文編輯 諸靜英)

Expression of programmed cell death 4 and its relationship with clinical stage and histodifferentiation in retinoblastoma

WULi,ZHOUYun-yun,CHENYing.

DepartmentofOphthalmology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China

WU Li, Email: wlpzy2007@163.com

Objective To investigate the expression of programmed cell death 4 (PDCD4) in retinoblastoma (RB) and its relationship with clinical stage and histodifferentiation. Methods Immunohistochemical technique was used to detect the expression of PDCD4 in RB samples of 35 cases. The quantitative analysis of the PDCD4 expression was assessed by using MPIAS-500 color pathologic analysis system. Results PDCD4 was expressed positively in the all 35 Rb specimens. The level of PDCD4 expression was significantly lower in RB than that in normal retina tissues (P<0.05). The expression of PDCD4 was related to the histodifferentiation and optic nerve infiltration (P<0.05). Conclusions The expressions of PDCD4 was associated with clinical stage and histodifferentiation in RB. PDCD4 may become a new marker for the invasion and prognosis of RB. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:403-405)

Retinoblastoma；Programed cell death 4；Immunohistochemistry；Histodifferentiation

武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科 武漢 430060

武犁 (Email: wlpzy2007@163.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.06.008

2015-06-05)