蘇 瑾，焦 鈞，于 蓮，孫維彤，胡艷秋，郭 宇（佳木斯大學(xué)藥學(xué)院省高校生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江佳木斯 154007）

山藥（Dioscoreaceae japonica）為薯蕷科植物薯蕷的干燥根莖，性平、味甘，有健脾除濕、補(bǔ)氣益腎等功效[1-2]。自古以來(lái)山藥就是藥食同源的保健食品之一，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)山藥主要含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、多糖、脂肪酸、游離氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分，具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能等藥理作用，其中多糖為山藥的主要活性成分之一[3-5]。近年來(lái)多糖作為降糖活性物質(zhì)的研究受到了人們的青睞，其對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的預(yù)防和治療具有藥性平和、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)。文獻(xiàn)顯示目前降糖藥物作用機(jī)制多以建立胰島素抵抗的細(xì)胞或動(dòng)物模型進(jìn)行研究[6-12]。為此，筆者研究山藥多糖對(duì)正常HepG2細(xì)胞及胰島素抵抗模型HepG2細(xì)胞體外降糖作用的影響，為下一步山藥多糖體內(nèi)降糖活性研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

3100型CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Tecan 公司）；A1130232 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；DW-HL388 型超低溫冷凍儲(chǔ)存箱（中科美菱低溫有限責(zé)任公司）；LS-C50L 型高壓蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）；TDZ4-WS臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

山藥多糖（陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：201101207，純度：95%）；胰島素（美國(guó)Sigma 公司）；鹽酸二甲雙胍片（河南興源制藥有限公司，批號(hào)：1305200，規(guī)格：0.25 g/片）；RPMI1640培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司）；葡萄糖試劑盒、胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物工程材料有限公司）；0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Gibco 公司）；青鏈霉素原液（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所）；磷酸鹽緩沖液（PBS，武漢博士德生物有限公司，pH 7.2～7.6）；MTT、二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自美國(guó)Amresco公司。

1.3 細(xì)胞

HepG2細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所）。

2 方法

2.1 山藥多糖對(duì)正常細(xì)胞的葡萄糖消耗試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常HepG2 細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，用10%FBS培養(yǎng)液吹打均勻，在倒置顯微鏡下調(diào)整細(xì)胞密度至1×104ml－1，每孔200 μl，接種于96孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，傾去培養(yǎng)液，更換無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清環(huán)境后再將培養(yǎng)液傾出，更換無(wú)血清含藥培養(yǎng)基。將正常HepG2 細(xì)胞分為正常對(duì)照（常規(guī)培養(yǎng)液）組、二甲雙胍（0.01 mg/ml）組與山藥多糖高、中、低濃度（質(zhì)量濃度分別為1.00、0.10、0.01 mg/ml）組，每孔100 μl，每組設(shè)3 復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 后，取40 μl 培養(yǎng)液用葡萄糖試劑盒檢測(cè)葡萄糖剩余含量，并計(jì)算葡萄糖消耗量（ΔGC），考察山藥多糖對(duì)正常HepG2細(xì)胞ΔGC影響；棄去培養(yǎng)液，加上無(wú)血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，以不鋪細(xì)胞的培養(yǎng)液為空白組。用葡萄糖試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖剩余含量，ΔGC＝空白組細(xì)胞葡萄糖含量－用藥組細(xì)胞葡萄糖含量。

2.2 山藥多糖對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞的葡萄糖消耗試驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常HepG2 細(xì)胞以1×104ml－1的密度接種于96孔板，每孔板200 μl，于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。加入含有胰島素的培養(yǎng)液，使胰島素的終濃度為1×10－7mol/L[13]以復(fù)制胰島素抵抗模型。將胰島素抵抗細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，用10%FBS培養(yǎng)液吹打均勻，在倒置顯微鏡下調(diào)整為細(xì)胞密度1×104ml－1的單細(xì)胞懸液，每孔200 μl，接種于96 孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，傾去培養(yǎng)液，更換無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清環(huán)境后再將培養(yǎng)液傾出，更換無(wú)血清含藥培養(yǎng)液。將胰島素抵抗細(xì)胞分為模型（常規(guī)培養(yǎng)液）組、二甲雙胍（0.01 mg/ml）組與山藥多糖高、中、低濃度（質(zhì)量濃度分別為1.00、0.10、0.01 mg/ml）組，每孔100 μl，每組設(shè)3 復(fù)孔；另設(shè)正常對(duì)照（常規(guī)培養(yǎng)液）組。培養(yǎng)24 h后，取40 μl培養(yǎng)液用葡萄糖試劑盒檢測(cè)葡萄糖剩余含量，按“2.1”項(xiàng)下方法計(jì)算ΔGC，考察山藥多糖對(duì)模型細(xì)胞ΔGC的影響。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將“2.2”項(xiàng)下各組細(xì)胞，置倒顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，并拍照記錄。

2.4 MTT試驗(yàn)

取“2.1”和“2.2”項(xiàng)下各組細(xì)胞培養(yǎng)液，分別加入20 μl MTT 溶液，37 ℃培養(yǎng)4 h 后，傾去上清液，加入200 μl DMSO，振蕩10 min 至紫色結(jié)晶溶解，用酶標(biāo)儀于490 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的光密度（OD）。OD水平代表細(xì)胞存活水平，以ΔGC/OD表示單位細(xì)胞ΔGC。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 正常HepG2細(xì)胞的ΔGC檢測(cè)結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，二甲雙胍組與山藥多糖高、中、低濃度組正常細(xì)胞ΔGC 增加，ΔGC/OD 增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；山藥多糖高、中濃度組正常細(xì)胞OD 減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果表明，山藥多糖可使單位細(xì)胞的ΔGC增加。各組正常HepG2細(xì)胞ΔGC的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組正常HepG2細(xì)胞的ΔGC檢測(cè)結(jié)果（，n＝3）Tab 1 Glucose consumption of normal HepG2 cells in each group（，n＝3）

表1 各組正常HepG2細(xì)胞的ΔGC檢測(cè)結(jié)果（，n＝3）Tab 1 Glucose consumption of normal HepG2 cells in each group（，n＝3）

注：與正常對(duì)照組比較，＊P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.01

3.2 胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的ΔGC檢測(cè)結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞ΔGC 減少，ΔGC/OD 降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，二甲雙胍組與山藥多糖高、中、低濃度組細(xì)胞ΔGC增加，ΔGC/OD升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；山藥多糖高、中濃度組細(xì)胞OD減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)果表明，山藥多糖可使單位胰島素抵抗HepG2細(xì)胞ΔGC增加。各組胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的ΔGC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞的ΔGC 檢測(cè)結(jié)果（，n＝3）Tab 2 Glucose consumption of insulin-resistant HepG2 cells in each group（，n＝3）

表2 各組胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞的ΔGC 檢測(cè)結(jié)果（，n＝3）Tab 2 Glucose consumption of insulin-resistant HepG2 cells in each group（，n＝3）

注：與正常對(duì)照組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.3 正常HepG2細(xì)胞與胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的形態(tài)

倒置顯微鏡下觀察，正常HepG2 和胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形、菱形、不規(guī)則形；兩組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)均未見(jiàn)明顯差別。正常HepG2細(xì)胞與胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 正常HepG2細(xì)胞與胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的形態(tài)A1.正常HepG2細(xì)胞（×200）；A2.正常HepG2細(xì)胞（×400）；B1.胰島素抵抗HepG2細(xì)胞（×200）；B2.胰島素抵抗HepG2細(xì)胞（×400）Fig 1 Cytomorphology photos of normal HepG2 cells and Insulin-resistant HepG2 cellsA1.normal HepG2 cells（×200）；A2.normal HepG2 cells（×400）；B1.Insulin-resistant HepG2 cells（×200）；B2.Insulin-resistant HepG2 cells（×400）

4 討論

HepG2 細(xì)胞來(lái)源于人肝胚胎瘤細(xì)胞株，其是一種表型與正常肝細(xì)胞極為相似的肝癌細(xì)胞，并且保留了正常肝細(xì)胞的特征和功能。2 型糖尿病主要是外周組織對(duì)胰島素不夠敏感（胰島素抵抗）造成血液中葡萄糖升高，因此采用HepG2 細(xì)胞胰島素抵抗模型來(lái)研究2型糖尿病是合適的。

研究結(jié)果證實(shí)山藥多糖不僅可以增加正常HepG2 細(xì)胞ΔGC，也能很好地增加胰島素抵抗HepG2細(xì)胞ΔGC，且呈劑量依賴(lài)性。MTT法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法，MTT數(shù)值高低代表細(xì)胞數(shù)的多寡[14-15]。MTT試驗(yàn)中，0.10、1.00 mg/ml質(zhì)量濃度下，山藥多糖對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，說(shuō)明用正常HepG2及胰島素抵抗HepG2單位細(xì)胞ΔGC（即ΔGC/OD）可以扣除細(xì)胞增殖的影響。本研究提示增強(qiáng)HepG2細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性可能是山藥多糖防治2 型糖尿病的作用機(jī)制之一，但山藥多糖降糖作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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