李海龍，孫 妍，姚 琳，馮文成，胡 昊，王偉明（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，哈爾濱 150036）

黃芩苷是黃芩的活性成分之一，有清熱解毒、抑菌抗炎等功效[1]。因黃芩苷具有廣泛的藥理作用，所以一直有著良好的臨床應(yīng)用價(jià)值；但其脂溶性差，體內(nèi)吸收率比較低，生物利用度差。因此，為了提高黃芩苷的生物利用度，黃芩苷的藥動學(xué)研究一直是受到關(guān)注較多的課題[2]。作為中藥復(fù)方拆方藥動學(xué)的前期研究，本課題組通過對大鼠血漿中黃芩苷的處理方法進(jìn)行研究，選出最優(yōu)處理方法，為黃芩苷的藥動學(xué)研究提供了處理方法依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

E2695型高效液相色譜（HPLC）儀、2489型紫外檢測器（美國Waters公司）；BSA224S-CW型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；SK250H型超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；LG16-W 型高速臺式離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；WH-3 微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器有限公司）；Milli-Q Reference System型超純水器（美國Millipore 公司）。

1.2 試劑

黃芩苷對照品（批號：110715-201016，純度：≥98%）、蘆丁對照品（批號：100080-200306，純度：91%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，美國Dikma 公司）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[3-4]

色譜柱：WATERS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.04%磷酸水溶液（38 ∶62，V/V），流速：1.0 ml/min；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。理論板數(shù)按黃芩苷計(jì)不少于3 000，黃芩苷與內(nèi)標(biāo)及其他雜質(zhì)峰分離良好。

2.2 溶液的制備

精密稱取黃芩苷對照品2.8 mg、蘆丁對照品7.9 mg，分別置于25、50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，得質(zhì)量濃度分別為112、158 μg/ml的黃芩苷、蘆丁貯備溶液，4 ℃貯藏，備用。

2.3 血漿樣品的采集

取Wistar 大鼠10 只，每只腹主動脈采血10 ml，置于肝素鈉負(fù)壓采血管中，以離心半徑為4 cm、4 000 r/min離心15 min，分離血漿，置于－20 ℃貯藏，備用。

2.4 血漿樣品的處理

于同一離心管中加入一定量的蘆丁液（內(nèi)標(biāo)，158 μg/ml）、1 ml黃芩苷對照品溶液（112 μg/ml），氮?dú)饬飨麓蹈桑芗尤胙獫{樣品200 μl混勻。按正交試驗(yàn)表進(jìn)行血漿樣品處理：加入磷酸、甲醇，渦旋，混合2 min，超聲一定時(shí)間萃取，以離心半徑為4 cm 第1 次離心一定時(shí)間（除蛋白沉淀），取上清液氮?dú)饬飨麓蹈?，?00 μl流動相復(fù)溶，渦旋混合1 min，以離心半徑為3 cm 第2 次離心一定時(shí)間（除血漿中雜質(zhì)）。每組3 個(gè)平行樣品。處理完成后取上清液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以測定量與加入量之比計(jì)算黃芩苷萃取回收率。

2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[5-9]

以黃芩苷萃取回收率為評價(jià)指標(biāo)，以磷酸量（A）、甲醇量（B）、超聲萃取時(shí)間（C）、離心轉(zhuǎn)速1（D）、離心時(shí)間1（E）、離心轉(zhuǎn)速2（F）、離心時(shí)間2（G）為考察因素，采用L18（37）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素與水平見表1；正交試驗(yàn)結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal test

由表2、表3 可知，各因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響程度依次為A＞B＞G＞C＞E＞D＞F，血漿處理方法最優(yōu)條件為A2B3C2D1E2F3G1，即加入磷酸50 μl、甲醇2 000 μl，渦旋混合2 min，超聲萃取10 min，以離心半徑為4 cm、3 000 r/min離心10min，取上清液于氮?dú)饬飨麓蹈?，?00 μl流動相復(fù)溶，渦旋混合1 min，以離心半徑為3 cm、14 000 r/min 離心5 min。以極值最小的F因素為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明A、B、C、E、G，即加入磷酸量、甲醇量、超聲萃取時(shí)間、離心時(shí)間對血漿中黃芩苷的萃取有顯著影響，且A＞B＞G＞C＞E。

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了確保提取工藝的重現(xiàn)性及可行性，于同一離心管中加入一定量的蘆丁液（內(nèi)標(biāo)）、1 ml黃芩苷對照品溶液，氮?dú)饬飨麓蹈?，精密加入血漿樣品200 μl混勻，平行5份，按血漿樣品方法處理下最優(yōu)條件操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計(jì)算黃芩苷萃取回收率。結(jié)果，5 份平行樣品的黃芩苷平均萃取回收率均高于正交試驗(yàn)組，表明處理?xiàng)l件為最優(yōu)條件；且5 份平行樣品的萃取回收率較為接近，表明按最優(yōu)處理方法處理大鼠血漿樣品比較穩(wěn)定。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Results of validation test

3 討論

通過測定正交試驗(yàn)黃芩苷的萃取回收率，在加入磷酸50 μl、甲醇2 ml，渦旋混合2 min，超聲萃取10 min，以離心半徑為4 cm、3 000 r/min 離心10 min，取上清液氮?dú)饬飨麓蹈?，?00 μl流動相復(fù)溶，渦旋混合1 min，以離心半徑為3 cm、14 000 r/min離心5 min的條件下，應(yīng)用HPLC法測定黃芩苷的峰形最好，血漿中的黃芩苷萃取回收效果最高。通過正交試驗(yàn)方差分析得出，加入磷酸量、甲醇量、超聲萃取時(shí)間、離心時(shí)間對血漿中黃芩苷萃取回收影響顯著。利用最優(yōu)萃取工藝，可最大限度萃取血漿中黃芩苷。

為了減少試驗(yàn)過程中的誤差，在樣品處理時(shí)，采用內(nèi)標(biāo)法，以蘆丁為內(nèi)標(biāo)物；通過參考文獻(xiàn)，在血漿樣品的處理時(shí)，通常采用甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑對血漿蛋白沉淀處理，蘆丁和黃芩苷在甲醇中有較好的溶解率，且本研究中HPLC 色譜條件水相為甲醇-磷酸水溶液，所以采用甲醇對樣品中血漿蛋白進(jìn)行沉淀。通過最佳樣品處理方法，樣品中黃芩苷和蘆丁的萃取回收率均能達(dá)到80%以上，且方法穩(wěn)定可行，符合要求[10]。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：282.

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