李志東，王 慧，張海娟，陳現(xiàn)偉，胡開良，劉旭海，馮尚彩#（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣州 510006；.臨沂大學(xué)山東省魯南中藥材資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心，山東臨沂 76000；.臨沂市人民醫(yī)院，山東臨沂 7600）

地衣藥用在我國《本草綱目》與民間醫(yī)藥書籍中早有記載[1]，《陜西七藥》記載的137 種七藥來源于54 科114 屬的153 種藥用植物，其中地衣類3屬5種[2]。老龍七為陜西七藥的一種，亦稱蛤蟆七、老龍皮、石龍衣等，為肺衣科（Lobariaceae）肺衣屬（Lobaria）植物光肺衣（Lobaria kurokawae Yoshim）的干燥全草，主治消化不良、腎炎水腫等癥[1，3-4]。

近年來，對老龍七提取物的藥理活性研究主要集中于抗炎、抑菌、抗氧化等活性研究方面[5-7]；對老龍七的化學(xué)成分研究表明，其主要的次級代謝產(chǎn)物為三萜酸類化合物[8-9]，具有抗菌、抗癌等活性[10-11]。老龍七在陜西秦嶺山區(qū)主要用于治療消化不良、腎炎水腫等癥，但對消化系統(tǒng)疾病的作用機(jī)制研究尚未見報(bào)道。本研究擬以兔離體小腸為研究對象，探討老龍七水提液對兔離體腸平滑肌收縮的影響及其作用機(jī)制，為該藥的藥效學(xué)研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

恒溫水浴鍋、BL-420E 型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、HW-400S 型恒溫平滑肌浴槽、FT-100型生物張力傳感器（成都泰盟科技有限公司）；GR-202 型電子分析天平（日本AND 公司）；移液器（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥材

老龍七藥材購自漢方養(yǎng)生堂有限公司（批號：130111，產(chǎn)地：陜西），由泰山醫(yī)學(xué)院孫麗彥副教授鑒定為真品。標(biāo)本保存在臨沂大學(xué)現(xiàn)代藥物研究院（No.2013sx0801）。

1.3 藥品與試劑

氯化乙酰膽堿（美國Alfa Aesar 公司，批號：10129040，純度：98%）；鹽酸阿托品注射液（山東華信制藥集團(tuán)股份有限公司，批號：13041401，規(guī)格：10 mg×2 ml）；試驗(yàn)所用試劑均為分析純；水為蒸餾水。

1.4 動(dòng)物

2 方法

2.1 臺(tái)氏液的配制

取NaCl 8 g、KCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.26 g、NaH2PO4·2H2O 0.065 g、NaHCO31 g、CaCl20.2 g、葡萄糖1 g，先將CaCl2用蒸餾水溶解完全，再加入其余6種物質(zhì)溶解，轉(zhuǎn)移至1 000 ml量瓶中，蒸餾水定容。

2.2 供試液的制備

準(zhǔn)確稱取老龍七藥材10.0 g，以蒸餾水提取2次，2次加水量均為400 ml，水沸后煎煮時(shí)間依次為30、20 min；2次煎液合并，濃縮并定容至50 ml，即得老龍七水提液[質(zhì)量濃度為200 g（生藥）/L]。制備氯化乙酰膽堿、鹽酸阿托品溶液質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5 g/L。需稀釋的供試液均以臺(tái)氏液稀釋。

2.3 離體腸的制備[12-13]

取健康大白兔，禁食24 h，不禁水。用槌猛擊其后枕部，使其暴死，迅速打開腹腔，以胃幽門與十二指腸交界處為起點(diǎn)剪取腸管，立即置于盛有混合氣體（95%O2和5%CO2）的飽和臺(tái)氏液中，洗去內(nèi)容物，剪成1.5～2.0 cm 左右，每只兔選擇較有規(guī)律的3段腸管進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4 老龍七水提液對兔離體腸平滑肌收縮的影響

打開BL-420E型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，調(diào)零，定標(biāo)，在“通道一”輸入接口處安裝張力換能器。調(diào)節(jié)恒溫平滑肌槽，使水溫保持在（37±0.5）℃，將臺(tái)式液加入預(yù)管內(nèi)，藥物管加入16 ml臺(tái)氏液。取一腸段，上端連接張力換能器，下端連于L型通氣鉤上，將腸管放入藥物管并固定，調(diào)節(jié)恒溫平滑肌槽，通入混合氣95%O2和5%CO2，標(biāo)準(zhǔn)負(fù)荷1 g，平衡30 min，待腸管收縮穩(wěn)定后，加藥[14]。

試驗(yàn)分為3 組，即對照（等容臺(tái)氏液）組與老龍七水提液①、②、③、④、⑤[0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g（生藥）/L]組，每組取6腸段。先描記腸管的正常運(yùn)動(dòng)曲線，然后用移液器向平滑肌槽中加入相應(yīng)藥物，給藥前后5 min，分別記錄腸管的運(yùn)動(dòng)波形。記錄兔離體腸平滑肌收縮頻率、振幅和張力，以上述3指標(biāo)為收縮效果指標(biāo)。每次給藥完成后，立即用預(yù)熱的臺(tái)氏液沖洗腸管至少3次，待腸管恢復(fù)收縮后，再進(jìn)行下一次給藥[12]。

2.5 老龍七水提液對乙酰膽堿誘導(dǎo)下兔離體腸平滑肌收縮的影響

在正常臺(tái)氏液條件下，待腸平滑肌收縮穩(wěn)定后，加入終質(zhì)量濃度為0.003 125 g/L 的乙酰膽堿，持續(xù)一定時(shí)間，待腸平滑肌振幅無變化后再加入質(zhì)量濃度為1.25 g（生藥）/L的老龍七水提液。試驗(yàn)分為3 組，即對照（等容臺(tái)氏液）組、乙酰膽堿（0.003 125 g/L）組與老龍七水提液[乙酰膽堿0.003 125 g/L+老龍七水提液1.25 g（生藥）/L]組。記錄兔離體腸平滑肌收縮頻率、振幅和張力。

2.6 老龍七水提液對阿托品誘導(dǎo)下兔離體腸平滑肌收縮的影響

在正常臺(tái)氏液條件下，待腸平滑肌收縮穩(wěn)定后，加入終質(zhì)量濃度為0.003 125 g/L的阿托品，持續(xù)一定時(shí)間，待腸平滑肌振幅無變化后再加入質(zhì)量濃度為1.25 g（生藥）/L 的老龍七水提液。試驗(yàn)分為3組，即對照（等容臺(tái)氏液）組、阿托品（0.003 125 g/L）組與老龍七水提液[阿托品0.003 125 g/L+老龍七水提液1.25 g（生藥）/L]組。記錄兔離體腸平滑肌收縮頻率、振幅和張力。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法[12-14]

3 結(jié)果

3.1 老龍七水提液對兔離體腸平滑肌收縮的影響

與對照組比較，老龍七水提液①、②、③、④、⑤組兔離體腸平滑肌收縮頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；老龍七水提液③、④、⑤組兔離體腸平滑肌振幅增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），老龍七水提液②、③、④、⑤組兔離體腸平滑肌張力增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果表明，在0.25～1.25 g（生藥）/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，兔離體腸平滑肌收縮頻率變化不大，但隨著質(zhì)量濃度的增加兔離體腸平滑肌振幅與張力也逐漸加大。不同質(zhì)量濃度老龍七水提液對兔離體腸平滑肌運(yùn)動(dòng)波形的影響見圖1；老龍七水提液對兔離體腸平滑肌收縮頻率、振幅與張力的影響見表1。

圖1 不同質(zhì)量濃度老龍七水提液對兔離體腸平滑肌運(yùn)動(dòng)波形的影響Fig 1 Effects of water extract with different concentrations of L.retigera on smooth muscle movement wave form

表1 老龍七水提液對兔離體腸平滑肌收縮頻率、振幅與張力的影響（，n＝6）Tab 1 Effects of L.retigera water extract on the frequency，amplitude and contractive tension of intestinal muscle spontaneous contractions（，n＝6）

表1 老龍七水提液對兔離體腸平滑肌收縮頻率、振幅與張力的影響（，n＝6）Tab 1 Effects of L.retigera water extract on the frequency，amplitude and contractive tension of intestinal muscle spontaneous contractions（，n＝6）

注：與對照組比較，＊P＜0.01Note：vs.control group，＊P＜0.01

3.2 老龍七水提液對乙酰膽堿誘導(dǎo)的兔離體腸平滑肌收縮的影響

各組間兔離體腸平滑肌收縮頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對照組比較，乙酰膽堿組兔離體腸平滑肌振幅、張力增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01 或P＜0.05）。與乙酰膽堿組比較，老龍七水提液組兔離體平滑肌振幅、張力增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，1.25 g（生藥）/L 老龍七水提液對乙酰膽堿的收縮兔離體腸平滑肌作用有刺激性。老龍七水提液對乙酰膽堿誘導(dǎo)下的兔離體腸平滑肌運(yùn)動(dòng)波形的影響見圖2；老龍七水提液對乙酰膽堿引起的兔離體腸收縮頻率、振幅與張力的影響見表2。

圖2 老龍七水提液對乙酰膽堿誘導(dǎo)下兔離體腸平滑肌運(yùn)動(dòng)波形的影響Fig 2 Effects of water extract of L.retigera on acetylcholine-induced intestine smooth muscle movement wave form

3.3 老龍七水提液對阿托品誘導(dǎo)的兔離體腸平滑肌舒張作用的影響

與對照組比較，阿托品組兔離體腸平滑肌頻率降低，振幅、張力減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與阿托品組比較，老龍七水提液組兔離體腸平滑肌頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），振幅、張力增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，1.25 g（生藥）/L老龍七水提液對阿托品舒張兔離體腸平滑肌有拮抗作用。老龍七水提液對阿托品誘導(dǎo)下兔離體腸平滑肌運(yùn)動(dòng)波形的影響見圖3；老龍七水提液對阿托品誘導(dǎo)下兔離體腸平滑肌舒張頻率、振幅與張力的影響見表3。

表2 老龍七水提液對乙酰膽堿誘導(dǎo)下兔離體腸平滑肌收縮頻率、振幅與張力的影響（，n＝3）Tab 2 Effects of water extract of L.retigera on the frequency，amplitude and contractive tension of acetylcholine-induced intestinal muscle spontaneous contractions（，n＝3）

表2 老龍七水提液對乙酰膽堿誘導(dǎo)下兔離體腸平滑肌收縮頻率、振幅與張力的影響（，n＝3）Tab 2 Effects of water extract of L.retigera on the frequency，amplitude and contractive tension of acetylcholine-induced intestinal muscle spontaneous contractions（，n＝3）

注：與對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與乙酰膽堿組比較，#P＜0.05Note：vs.control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.acetylcholine group，#P＜0.05

圖3 老龍七水提液對阿托品誘導(dǎo)下兔離體腸平滑肌運(yùn)動(dòng)波形的影響Fig 3 Effects of water extract of L.retigera on atropine-induced intestinal smooth muscle movement wave form

表3 老龍七水提液對阿托品誘導(dǎo)下兔離體腸平滑肌舒張頻率、振幅與張力的影響（，n＝3）Tab 3 Effects of water extract of L.retigera on the frequency，amplitude and relaxation tension of atropine-induced intestinal smooth muscle contractions（，n＝3）

表3 老龍七水提液對阿托品誘導(dǎo)下兔離體腸平滑肌舒張頻率、振幅與張力的影響（，n＝3）Tab 3 Effects of water extract of L.retigera on the frequency，amplitude and relaxation tension of atropine-induced intestinal smooth muscle contractions（，n＝3）

注：與對照組比較，＊P＜0.01；與阿托品組比較，#P＜0.05Note：vs.control group，＊P＜0.01；vs.atropine group，#P＜0.05

4 討論

老龍七為陜西七藥的一種，為肺衣科肺衣屬光肺衣植物的干燥全草。地衣類植物是菌藻共生體，其主要成分為地衣多糖和地衣酸[15]。老龍七水提液主要化學(xué)成分有地衣多糖、皂苷、鞣質(zhì)、氨基酸、酚類以及部分有機(jī)酸等[7]，在陜西秦嶺山區(qū)主要用于治療消化不良、腎炎水腫等癥。本研究結(jié)果顯示，老龍七水提液對正常收縮條件下的兔離體腸平滑肌收縮振幅和張力有明顯增強(qiáng)作用；對乙酰膽堿誘導(dǎo)的兔離體腸平滑肌的收縮具有協(xié)同作用；對阿托品誘導(dǎo)的兔離體腸平滑肌的舒張具有對抗作用。結(jié)果表明，老龍七水提液對兔離體腸平滑肌收縮具有明顯增強(qiáng)作用，這一結(jié)果在一定程度上與其民間藥用的作用是一致的，其作用機(jī)制可能與M受體興奮性有關(guān)。

M受體廣泛分布于全身各平滑肌組織中，包括胃腸道、子宮平滑肌等，其在維持全身平滑肌收縮狀態(tài)時(shí)起主要作用[16]。乙酰膽堿為M 受體激動(dòng)藥，當(dāng)乙酰膽堿與腸平滑肌上的乙酰膽堿受體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后，引起M受體構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，從而使乙酰膽堿受體偶聯(lián)的離子通道開啟，因胞內(nèi)外存在的離子濃度差導(dǎo)致膜去極化，引起平滑肌細(xì)胞收縮[17]。阿托品作為M 受體拮抗藥，具有解痙作用，可通過拮抗兔離體腸平滑肌上M受體使平滑肌舒張[18-19]。研究表明，老龍七提取液可明顯增強(qiáng)乙酰膽堿誘導(dǎo)的M 受體的興奮性，并拮抗M 受體拮抗藥阿托品引起的舒張。這提示，老龍七對兔離體腸平滑肌收縮的激動(dòng)作用可能與興奮兔離體腸平滑肌上的M 受體有關(guān)；但其對兔離體腸平滑肌上的H1受體、鈣離子通道等是否具有興奮作用，尚需進(jìn)一步研究。

[1]吳金陵.秦嶺藥用地衣[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1981，16（3）：161.

[2]郭增軍，卜筱茜，王軍憲，等.陜西“七藥”植物資源及研究概要[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，2006（79）：79.

[3]任茜，陳國聯(lián)，李萬波.80種秦嶺七藥原植物抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].國土與自然資源研究，2013（1）：86.

[4]周莉英，仝武寧，王西芳，等.秦嶺低海拔七種資源種類的調(diào)查研究[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，35（6）：106.

[5]王曉梅，李健，李宗孝，等.老龍皮提取物的體外抗氧化活性研究[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥，2010，30（5）：79.

[6]楊曉莉，羅晶，郭耀武，等.老龍皮水和乙醇提取部位的抗炎和體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究[J].陜西中醫(yī)，2012，33（10）：1 434.

[7]杜遠(yuǎn)東.老龍皮的藥效物質(zhì)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].西安：陜西中醫(yī)學(xué)院，2012.

[8]張海娟，歐揚(yáng)，婁紅祥.光肺衣的化學(xué)成分研究[J].中藥材，2007，30（6）：651.

[9]Wang XN，Zhang HJ，Ren DM，et al.Lobarialides A-C，antifungal triterpenoids from the lichen Lobaria kurokawae[J].Chem Biodivers，2009，6（5）：746.

[10]Sun LM，Cheng AX，Wu XZ，et al.Synergistic mechanisms of retigeric acid B and azoles against Candida albicans[J].J Appl Microbiol，2009，108（1）：341.

[11]Liu YQ，Gao FB，Jiang HM，et al.Induction of DNA damage and ATF3 by retigeric acid B，a novel topoisomerase Ⅱinhibitor，promotes apoptosis in prostate cancer cells[J].Cancer Letters，2013，337（28）：66.

[12]王慧，俞春紅，許建平，等.血根堿對兔離體腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的舒張作用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（17）：3 669.

[13]溫小萍，鄧卅，林原，等.山楂水提物對大鼠離體胃、腸平滑肌條收縮性的影響研究[J].中國藥房，2010，21（11）：978.

[14]程艷芹，孫秀梅，張兆旺，等.甘草5種方法提取液對兔離體腸平滑肌的影響[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25（1）：49.

[15]房敏峰，王啟林，胡正海.地衣化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2011，42（12）：2 571.

[16]Hansen MB.The enteric nervous system Ⅱ：gastrointestinal functions[J].Pharmacol Toxicol，2003，92（6）：249.

[17]Sanders KM.Regulation of smooth muscle excitation and contraction[J].Neurogastroenterol Motil，2008，20（Suppl 1）：39.

[18]Ambache N，Anne FM.Atropine-resistant longitudinal muscle spasms due to excitation of non-cholinergic neurones in Auerbach’s plexus[J].J Physiol，1968，199（3）：705.

[19]Larrel WH，William CH，David LS，et al.Effect of atropine and/or physostigmine on cerebral acetylcholine in rats poisoned with Soman[J].Life Sci，1978，22（10）：907.