王萬賢, 柯文山,*, 吳明煜, 孫啟祥, 彭鎮(zhèn)華, 尹蔚琳, 張 倩

1 湖北大學生命科學院, 武漢 430062 2 中國林業(yè)科學研究院, 北京 100091

樟樹水浸液對釘螺的生態(tài)毒理學效應

王萬賢1, 柯文山1,*, 吳明煜1, 孫啟祥2, 彭鎮(zhèn)華2, 尹蔚琳1, 張 倩2

1 湖北大學生命科學院, 武漢 430062 2 中國林業(yè)科學研究院, 北京 100091

用樟樹(Cinnamomumcamphora)新鮮根皮、莖皮、葉為材料，設置1%、0.5%、0.1%、0.05% 4個不同濃度梯度的水浸液處理釘螺，以清水和1 mg/L濃度的氯硝柳胺溶液為對照，統(tǒng)計釘螺死亡率，并分析釘螺過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性及采用透射電鏡分析亞顯微結構損傷情況。結果表明：(1)樟樹各部分的水浸液均有很好的滅螺效果。釘螺死亡率隨處理濃度的增加和時間的延長呈上升趨勢，0.5%— 1.0% 以上的樟樹根皮、莖皮、葉水浸液均可達到100%的毒殺釘螺致死效果，與1 mg/L氯硝柳胺溶液的滅螺效果相當；滅螺效果順序依次為：根皮>莖皮>葉。(2)在處理初期，釘螺體內過氧化氫酶和過氧化物酶活性明顯增強，但隨處理時間延長，其活性急劇降低；過氧化物酶同工酶譜顯示，處理24—48 h后釘螺酶活高于對照組，處理72—96 h后酶活最強，而處理120 h酶活則大大減弱。(3)釘螺肝細胞亞顯微結構觀察表明，隨處理時間的延長，線粒體、內質網、細胞核等結構損傷越來越嚴重。這些結果表明樟樹水浸液對釘螺肝臟造成過氧化傷害和細胞器結構損傷，具有很好的殺螺效果，可作為生態(tài)工程抑螺林樹種。

樟樹；釘螺；殺螺活性；生態(tài)工程抑螺；血吸蟲病

血吸蟲病(Schistosomiasis)是嚴重危害人民身體健康的疾病，而釘螺(OncomelaniahupensisGredler)是日本血吸蟲(SchistosomajaponicumKatsurade)的唯一中間寄主，是血吸蟲病傳播中不可缺少的環(huán)節(jié)[1- 2]。血吸蟲的毛蚴在釘螺內成千上萬倍的急劇增殖，不斷逸出尾蚴于水中感染人體和其它動物，致使血吸蟲病蔓延傳播[3]。另一方面，釘螺也是血吸蟲生活周期中最脆弱的一環(huán)，滅螺能有效地控制和減少血吸蟲病的傳播[4]。近半個世紀以來，滅螺措施倍受重視[5- 7]，成為控制血吸蟲病的重心。傳統(tǒng)的滅螺方法主要是物理和化學方法[8]，物理方法工程浩大難徹底；化學藥物滅螺效果雖好，但污染環(huán)境?！芭d林滅螺”模式的提出，為有效滅螺提供了一條新的途徑，如果選用對釘螺有毒害作用的植物造林，創(chuàng)建一個釘螺無法生存的生態(tài)環(huán)境，則能一勞永逸達到控制的目的。在調查中發(fā)現(xiàn)，樟樹(Cinnamomumcamphora(L.)Presl)在武漢東湖、沙湖及池塘邊、溝渠旁等濕潤的地方也能生長得很好，尤其是在每年的3—4月份開花和長出新葉時，其上的老葉紛紛飄落于地面，此時也正是滅螺的最宜時機，休眠了一個冬季的釘螺開始出土活動和交配繁殖。樟樹為傳統(tǒng)優(yōu)良常綠綠化樹種，還有殺蟲、滅菌的效果。鑒于以上原因我們擬采用樟樹各部分新鮮材料水浸液進行滅螺實驗，并對釘螺生理生化作用進行分析，探討樟樹滅螺的可能性及其作用生理生化機制，旨在為生態(tài)工程滅螺提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗用樟樹的根皮、莖皮、葉采自湖北大學校園沙湖及池塘邊，溝渠旁；釘螺采自湖南省洞庭湖。采集的釘螺于實驗室23℃溫室飼養(yǎng)，選取7—8旋成螺，逸幼法剔去陽性螺(將釘螺放入盛有去氯清水(自來水放置1周)的小燒杯中，沖洗干凈并靜置2 h后，如有血吸蟲尾蚴溢出，則剔除)，于無氯清水中喂養(yǎng)備用。

1.2 滅螺活性的測定

實驗采用浸泡法。將采到的樟樹根皮、莖皮、葉清洗，切碎，按相當于干重的比例浸入適量的無氯清水中，分別配成1%、0.5%、0.1%、0.05% 4個不同濃度梯度的處理溶液。選取健康釘螺100只為1組，每20個裝入一個尼龍網袋中，分別將各組(5袋/組)釘螺浸入盛有2000 mL不同濃度的樟樹根皮、莖皮、葉水溶液的玻璃缸中，另設1 mg/L氯硝柳胺水溶液處理和無氯清水飼養(yǎng)為對照。實驗在溫度控制在(23±1)℃條件下進行。分別于處理24、48、72、96、120 h后，將各處理中的釘螺隨機取出1袋，用無氯水沖洗數(shù)次，再放入清水中靜置24h，然后作存活檢查,開厴爬行者為活螺，余下的用敲碎和解剖卸刺的方法，鑒別死活。實驗重復3次，取其平均值作為實驗結果。

1.3 CAT和POD活性測定

粗酶液的制備，分別隨機選取各處理濃度下的釘螺，用預冷的生理鹽水漂洗后，吸水紙吸干，敲碎螺殼，取出肝臟組織，分別加按照重量∶體積=1∶9加預冷的0.86%的生理鹽水，用研缽在冰浴下充分勻漿，0—4 ℃條件下4000 r/min離心20 min，上清液在4 ℃下保存待測。

酶活測定，本實驗過氧化氫酶(CAT)的活力測定采用可見光分光光度法，過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，組織蛋白測定采用考馬斯亮藍方法。CAT、POD和考馬斯亮藍測定蛋白質試劑盒購自南京建成生物工程研究所，其測定原理和方法見試劑盒說明。

粗酶液中CAT酶活力的計算：

粗酶液中CAT活力(U/mg蛋白)=(對照管吸光度值-測定管吸光度值)×271÷(60×取樣量)/待測樣品蛋白含量(mg蛋白/mL)。

POD以用每min內A470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位(U)表示。

POD活力(U/mg蛋白)△A470=對照管吸光度值-測定管吸光度值

1.4 同工酶電泳

將濃度為0.5% 的樟樹新鮮葉水浸液處理不同天數(shù)的釘螺樣品取出，并用無氯清水漂洗干凈，吸干水分，敲碎螺殼，取出整個軟體組織，分別加0.2 mol/L pH7.4的磷酸緩沖液﹝10﹞，冰浴勻漿。勻漿液0℃ 8000 r/min冷凍離心，上清液與溴酚藍指示劑等量混合后作為電泳樣品，零下20攝氏度的冰箱保存?zhèn)溆?。正常飼養(yǎng)螺作為對照組。

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。使用Hoefer SE600垂直板電泳儀，所有電泳及染色藥品均為亞法公司進口分裝。貯液配制參照B. D. Hames和D. Rickwood等以及Hoefer公司電泳指南，樣品分離膠濃度7.5%，濃縮膠3%。采用Tris-Gly高pH不連續(xù)緩沖系統(tǒng)(7.5%分離膠- 3%濃縮膠)，板距1 mm，板膠16 mm x17 mm。每槽加樣15 μL，加1滴0.2%的溴酚藍作為指示劑，恒流20 mA，22℃條件下電泳，待溴酚藍泳動到凝膠板下端1 cm處停止電泳。染色，沖洗，固定，拍照。

1.5 樟樹水浸液對釘螺肝臟損傷的透射電鏡觀察

分別取清水飼養(yǎng)(以下簡稱對照)、0.5%的樟樹葉水浸液處理48、96 h的釘螺的肝臟部分作切片。將釘螺肝臟用刀片切成1 mm3的小塊放于4 ℃預冷的2.5%戊二醛中前固定2 h，再經1%鋨酸后固定2 h，逐級酒精及丙酮脫水。1∶1純丙酮與618環(huán)氧樹脂包埋液室溫浸透2—3 h，純包埋液浸透2—3 h，37 ℃→45 ℃→60 ℃聚合36 h。將制作的切片在透射電鏡下觀察拍照。實驗過程在武漢大學醫(yī)學部電子顯微鏡室完成。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗每處理重復3次，取平均值，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Excel數(shù)據(jù)分析中的t檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 樟樹根皮、莖皮、葉水浸液滅螺活性初試結果與分析

樟樹根皮、莖皮、葉水浸液不同濃度、不同時間處理后，釘螺死亡率存在差異。其規(guī)律是隨處理濃度和處理時間的增加，釘螺死亡率呈上升趨勢。0.5%—1.0% 以上的樟樹根皮、莖皮、葉水浸液均可達到100%的明顯毒殺釘螺致死效果(表1)。

樟樹凋落葉水浸液的滅螺效果(表1)與新鮮葉的滅螺效果表現(xiàn)出極為相似的規(guī)律性，但其滅螺效果明顯低于新鮮葉：如1.0%濃度凋落葉水浸液處理釘螺120 h后釘螺死亡率才達到80%，而同濃度新鮮葉處理72 h后則可達91.7%，原因可能是凋落葉的一部分滅螺活性成分已經被酶或微生物降解。但是，樟樹在每年的3—4月份在釘螺出土活動和交配繁殖時集中落葉于地面，高濃度的樟樹凋落葉水浸液也許會有比新鮮葉更理想的滅螺效果。

氯硝柳胺是普遍使用的化學滅螺劑。將樟樹根皮、莖皮、葉水浸液的滅螺效果與之對照，可知0.5—1.0% 以上的樟樹根皮、莖皮、葉水浸液均可達到100%的明顯毒殺釘螺致死效果，與1 mg/L氯硝柳胺溶液的滅螺效果相當。不過樟樹根皮、莖皮、葉水浸液的毒效較氯硝柳胺略慢。用1 mg/L氯硝柳胺溶液處理釘螺48—72 h可達100%的死亡率，而用0.5—1.0% 以上的樟樹根皮、莖皮、葉水浸液水溶液處理需要72—120 h才能達到同樣的效果(表1)。

表1 根皮、莖皮、葉水浸液滅螺效果統(tǒng)計Table 1 The mortality of snails treated by the lixivium of leaf, bark of stem and root of C. camphora

2.2 樟樹葉水浸對釘螺過氧化氫酶和過氧化物酶活性影響

過氧化氫酶和過氧化物酶是過氧化物酶體主要酶類，且過氧化物酶體的標志酶是過氧化氫酶,是釘螺體內防止過氧化物毒害的主要酶類。本實驗中，過氧化氫酶(圖1)在處理的48 h內，過氧化物酶(圖2)在處理的72 h內，其活性明顯增加，表明其處理過氧化損傷能力增強。但隨處理時間的延長，其活性明顯降低，表明清除能力降低。

圖1 0.5%樟樹葉水浸液處理不同時間CAT(Catalase)酶活性Fig.1 CAT (Catalase) activity of Oncomelania hupensis live treated by 0.5% leaf water extract from Cinnamomum camphora不同字母表示顯著差異(P < 0.05)

圖2 0.5%樟樹葉水浸液處理不同時間POD (Peroxidase)酶活性Fig.2 POD (Peroxidase) activity of Oncomelania hupensis live treated by 0.5% leaf water extract from Cinnamomum camphora

2.3 過氧化物酶(POD)同工酶電泳結果與分析

圖3 0.5% 樟樹新鮮葉水浸液處理1—5 d釘螺的過氧化物酶同工酶圖譜Fig.3 POD Isozyme Profiles of liver treated by 0.5% water lixivium of leaf of C. camphora *CK, CK′：對照樣品；1, 1′： 0.5% 樟樹新鮮葉水浸液處理24 h釘螺的樣品；2, 2′：處理48 h釘螺的樣品；3, 3′：液處理72 h釘螺的樣品；4, 4′：處理96 h釘螺的樣品；5, 5′：處理120 h釘螺的樣品；圖上為正極，下方為負極

采用聚丙稀酰胺電泳技術分離經0.5% 樟樹新鮮葉水浸液處理不同天數(shù)的釘螺樣品的過氧化物酶同工酶(圖3)。未做酶譜的薄層掃描，但從帶譜消失或新帶出現(xiàn)及凝膠顯色顏色的深淺或寬度，可以大致判斷過氧化物酶帶譜在不同處理時間后的變化情況及其活性強弱。

雖然圖不是很清楚看出帶譜，但在電泳膠圖中可見其：清水對照共有12條譜帶，樟樹水浸液處理后的前3d的譜帶數(shù)均為11條，比對照少一條，但是處理24 h后的酶的活性比對照增強，第48—72小時酶的活性增強地更加明顯，96 h酶帶數(shù)增加一條，但是酶的活性開始下降，120 h的酶帶數(shù)與72 h相比減少1條，而96 h剛增加的新酶帶120 h又消失了，酶的活性繼續(xù)下降，酶帶的變化也主要是在正極區(qū)，處理的72 h，由于樟樹水浸液中的滅螺活性物質刺激釘螺，釘螺中毒后發(fā)生應激反應，所以酶的活性不斷上升，96 h由于中毒太深，酶最終被破壞，所以酶的活性下降，而酶帶的增減可能也是應激反應所致。這與正常的病理反應完全一致。

2.4 樟樹水浸液對釘螺肝臟損傷的透射電鏡觀察

從圖4結果可知：對照組(圖4A—C)釘螺肝臟細胞的細胞核完整，粗面型內質網整齊排列在細胞核的周圍，細胞質中清晰可見高爾基體、溶酶體等細胞器分布，線粒體大量聚集，數(shù)量多;處理48 h(圖4D—F)后，其細胞核輕度腫脹甚至核膜破損，染色質疏松，線粒體數(shù)目減少、凝聚或破裂，粗面內質網腔擴大或破損、呈片段狀散在性分布，胞質稀疏，同時出現(xiàn)少量的致密體，高爾基體等細胞器的結構不完整;處理96 h后(圖4G—I)，細胞核溶解破碎，僅有少量凝集融合的染色體斑塊，細胞器出現(xiàn)空泡樣變性，線粒體嵴模糊，大量的致密體及形狀、大小不等的空泡充滿了整個細胞，胞膜不完整。

3 討論

樟樹植物各部的新鮮材料水浸液對釘螺都具有較強的殺螺作用，其中根皮效果最好，1%濃度處理72 h釘螺死亡率達100%，其次為莖皮和葉。樟樹含生物堿、萜類、樟腦、揮發(fā)油等多種活性成分，劉穎芳[9]曾用對樟樹不同有機溶劑提取物進行殺螺效果試驗，證明均具有殺螺活性，表明樟樹殺螺可能為多種有效成分的綜合作用；但具體是何種活性成分對釘螺最強有待進一步研究。樟樹凋落葉和新鮮葉水浸液的滅螺效果表現(xiàn)出相同的濃度和時間效應：隨處理濃度的增加和時間的延長，釘螺死亡率呈上升趨勢；但凋落葉的滅螺效果明顯低于新鮮葉(表1)，原因可能是凋落葉的一部分滅螺活性成分已經被酶或微生物降解。然而，樟樹落葉在每年的3—4月份，這個時間段正好是釘螺在休眠了一個冬季后，開始出土活動和交配繁殖集中的時間段，也是釘螺脆弱的時候，正是滅螺的最佳時機，大量的落葉水浸后形成高濃度水浸液，也許會有比新鮮葉更理想的滅螺效果。

圖4 0.5%樟樹葉水浸液處理釘螺肝臟投射電鏡圖(TEM)Fig.4 TEM ultrastracture of O. hupensi′s liver treated by 0.5% leaf water extract from C. camphora Bar=30 m; A—C 為對照處理，顯示正常細胞的細胞器亞顯微結構；D—F 顯示釘螺處理24h后肝細胞結構損傷；G—I 顯示釘螺處理96h后肝細胞結構損傷

過氧化物酶體在動物廣泛存在，尤其肝臟，其含有豐富的酶類，主要是氧化酶，如過氧化氫酶和過氧化物酶，且過氧化氫酶是其標志酶，它的作用主要是將過氧化氫(H2O2)水解。肝臟是解毒器官，外源毒物進入釘螺肝臟，其中毒害機制可能會引起過氧化損傷，如產生過氧化氫(H2O2)是氧化酶催化的氧化還原反應中產生的細胞毒性物質。 過氧化氫酶利用過氧化氫氧化各種底物，氧化的結果使這些有毒性的物質變成無毒性的物質，同時也使H2O2進一步轉變成無毒的H2O。這種解毒作用對于肝、腎的保護作用特別重要。從實驗結果看，過氧化氫酶(圖1)在樟樹葉水浸液處理的48 h內、過氧化物酶(圖2)在72 h內，其活性明顯增強，表明水浸液成分引起的過氧化在增加，釘螺此時的具有明顯的解毒作用；但隨著處理時間的延長，CAT和POD活性明顯降低，表明其解毒能力在降低，外源毒物引起的過氧化物在積累、過氧化損傷在增加。隨著有毒物的進一步積累、過氧化損傷進一步增加，釘螺解毒能力逐漸消失，這可能是導致釘螺死亡重要原因之一。從過氧化物酶同工酶沒譜變化(過氧化氫酶同工酶因條帶不清晰，未能在本文顯示)，也可看出隨處理時間的延長，其部分酶帶減弱甚至消失，也表明釘螺解毒能力的減弱和可能的過氧化損傷。

透射電鏡結果表明，釘螺肝臟隨樟樹葉水浸液處理時間的延長，其線粒體、內質網、細胞核的細胞器破損程度越來越嚴重，進一步說明樟樹葉水浸液毒性成分對釘螺肝臟的損傷。

當前國內外通常采用化學藥物滅螺[10- 11]。但化學滅螺劑污染環(huán)境[12]；物理控制也是經常采用的，但其工程浩大很難一次徹底[13]?？梢栽O想：在釘螺孳生的江灘、湖洲及溝渠兩旁選用對釘螺有強他感作用的植物造林，創(chuàng)建一個釘螺難以生存繁衍的生態(tài)環(huán)境，不需年年施用滅螺藥物，即使有流水攜螺而至，也能隨來隨滅，便可一勞永逸地達到殺滅釘螺的目的。且抑螺林的構建費工耗資不多，也不污染環(huán)境，還具有防風浪，護堤坡及材用，綠化等多種綜合效益。樟樹為多年生的常綠植物，生態(tài)適應能力強，在武漢東湖、沙湖及池塘邊，溝渠旁等濕潤的地方也能生長得很好，是構建人工生態(tài)防護林的理想樹種。

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Ecotoxicological effects of water extract ofCinnamomumcamphoraon oncomelania hupensis

WANG Wanxian1, KE Wenshan1,*, WU Mingyu1, SUN Qixiang2, PENG Zhenhua2, YIN Weilin1, ZHANG Qian2

1InstituteofBiologyandScience,HubeiUniversity,Wuhan430062,China2ResearchInstituteofForestry,ChineseAcademyofForestry,Beijing100091,China

Control of infection by Schistosomiasis, which causes a severe health problem in human, has been a challenging task for most endemic countries in the tropics and subtropics. Schistosomiasis remains a public health concern in China after a concerted effort in the past decades.Oncomelanniahupensis, the only intermediate host of Schistosome, is regarded as the weakest link in the life cycle of Schistosome. KillingO.hupensiscan control the epidemic of Schistosomiasis in public water sources. Plant molluscicide is considered as the best reagent as judged by public safety, financial cost, and environmental protection. We usedCinnamomumcamphorahere in this experiment. Extract of leaf, barks of root and shoot ofC.camphorawere used at 4 concentrations(1%, 0.5%, 0.1% and 0.05%) (water and 1mg/L Niclosamidum as the control)in the experiment against snailsO.hupensis. The mortality of snails was investigated. The activities of catalase (CAT), peroxidase (POD) and TEM ultralstructure ofO.hupensisliver cell were analyzed in the experiment. The results showed that the molluscicidal effect of the lixivium of C.camphroaagainst O.hupensisis excellent. The mortality of the snails correlated with the concentrations of the lixivium and the time of treatment. The mortality of the snails treated with water extracts from leaf, barks of root and shoot of C.camphorain 4 concentrations in 120 h was up to 100%, which is similar with that of 1mg/L Niclosamidum. The molluscicidal activity order of different parts from C.camphroaagainst O.hupensisranks: root bark > stem bark > leave. Treatment with 0.5% leaf water extract induced a significant increase of the activities of CAT and POD in the early period time points (48 h and 73 h respectively) followed by a dramatic decrease. Further more, 0.5% water extract of leaf causes a marked damage in liver as judged by the TEM ultrastructure analysis. For example, 48 h treatment with 0.5% leaf water extract caused a slight damage to nuclei of hepatocytes of the snail, which manifested as slightly nuclei swelling; loosed chromatin; reduced number of mitochondria and even condensed or ruptured mitochondria; expanded or fragmented reticulum cavity of rough endoplasmic in cytoplasm. The damage to hepatocytes was further exaggerated 72 h after treatment: broken nuclei of hepatocytes; reduced chromatin mass; organelles cavitation; vague and broken mitochondria Cristae. These hepatocytes were filled with dense bodies and different types of gas vacuoles. The cell membrane was raptured. We conclude that the plant C.camphroademonstrates a strong molluscicidal activity in a peroxide-dependent manner, which damages the organelles of hepatocytes. Thus, C.camphroawill be better plant resource in controlling the snails in ecological projects.

Cinnamomumcamphora(L.) Presl;Oncomelaniahupensis; molluscicidal activity; control snails in ecological project; schistosomiasis.

國家自然科學基金項目(30471506, 30570322); 國家“十二五”科技支撐項目(2011BAD38B07); 教育部(西南大學)三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境重點實驗室開放基金; 武漢市科技局資助項目(080- 098045, 080- 097181)

2013- 05- 11;

日期:2014- 07- 07

10.5846/stxb201305111016

*通訊作者Corresponding author.E-mail: kokews2000@163.com

王萬賢, 柯文山, 吳明煜, 孫啟祥, 彭鎮(zhèn)華, 尹蔚琳, 張倩.樟樹水浸液對釘螺的生態(tài)毒理學效應.生態(tài)學報,2015,35(3):919- 925.

Wang W X, Ke W S, Wu M Y, Sun Q X, Peng Z H, Yin W L, Zhang Q.Ecotoxicological effects of water extract ofCinnamomumcamphoraon oncomelania hupensis.Acta Ecologica Sinica,2015,35(3):919- 925.