楊勝+熊兵紅+馬利+程勇+張才全

摘要：目的 探討p16和CD44v6在胃癌中的表達(dá)規(guī)律及其臨床意義。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP方法，對93例胃癌中p16和CD44v6的表達(dá)進(jìn)行了觀察。結(jié)果 胃癌組織中p16和CD44v6蛋白的總陽性率分別是39.78%（37/93）和41.94% （39/93）（P<0.05，P<0.05）。p16的表達(dá)與胃癌的分化程度和預(yù)后呈正相關(guān)，與胃癌TNM分期、浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。CD44v6的表達(dá)與胃癌的TNM分期、浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。p16和CD44v6的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.476，P=0.007）。結(jié)論 p16和CD44v6參與了胃癌的進(jìn)展過程，并與胃癌的生物行為相關(guān)，是胃癌的診斷和判斷預(yù)后的重要分子生物學(xué)檢測指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：p16；CD44v6；胃癌

胃癌預(yù)后的改善和治療效果的提高，有賴于對胃癌發(fā)病機(jī)制逐步深入的認(rèn)識。從蛋白質(zhì)分子水平揭示其發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。研究表明，細(xì)胞癌變是由于細(xì)胞內(nèi)某些基因的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變而引起。在人類多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)p16和CD44v6基因的異常改變和異常表達(dá).并與惡性腫瘤的臨床指標(biāo)和預(yù)后有關(guān)，p16基因是近年發(fā)現(xiàn)的新的抑癌基因。胃癌組織中pl6蛋白的表達(dá)情況，目前國內(nèi)外少有報道。細(xì)胞跨膜粘附分子CD44v6在人類不同類型腫瘤的表達(dá)，可能成為腫瘤抗體導(dǎo)向治療的基礎(chǔ)。我們采用免疫組化技術(shù)，對93例胃癌的p16和CD44v6的表達(dá)進(jìn)行研究，探討其同胃癌的發(fā)生、發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料 93例胃癌標(biāo)本為本院和外院2008年1月～2011年12月胃癌手術(shù)標(biāo)本，男60例，女33例。平均年齡56.8歲。早期胃癌l1例，進(jìn)展期胃癌82例，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性65例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性28例。Lauren分型示腸型胃癌61例，彌漫型胃癌32例。實(shí)驗(yàn)采用存檔蠟塊。另取該組胃腺癌病例中腫瘤手術(shù)切除標(biāo)本切緣處正常胃粘膜（病理證實(shí)）石蠟包埋標(biāo)本15例及癌旁粘膜15例作為對照。胃癌的TNM分期按照2010年國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會（UICC/AJCC）胃癌 TNM分期 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2組織學(xué)檢測采用常規(guī)蘇木素-伊紅染色。

1.3免疫組化檢測 一抗分別為鼠抗人pl6單克隆抗體（稀釋濃度1：100）、鼠抗人CD44v6單克隆抗體（稀釋濃度1：100）及SP超敏即用型試劑盒等均由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司提供。組織經(jīng)10 %中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚度4 um，連續(xù)切片分別做常規(guī)HE和免疫組織化學(xué)SP染色，免疫組織化主要操作步驟：嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。陰性對照用PBS代替一抗，用已知的陽性組織切片作陽性對照。

1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定 pl6蛋白陽性著色主要定位于胞漿，部分胞核呈陽性染色，胞漿呈棕黃色或呈明顯棕黃色顆粒；CD44v6蛋白蛋白主要以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色染色為陽性，可同時伴或不伴有胞漿彌漫性著色。鏡下觀察10個高倍鏡視野（10×40），并根據(jù)陽性細(xì)胞占視野中癌細(xì)胞總數(shù)的比例分為（-）：細(xì)胞內(nèi)無棕黃色著色，或與切片背景染色一致者；（+）：陽性細(xì)胞<25 %；（+ +）：陽性細(xì)胞為25 %-50% ；（+++）：陽性細(xì)胞>50 %。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0版本統(tǒng)計學(xué)軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。兩樣本均數(shù)比較行t檢驗(yàn)，計數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1胃癌按細(xì)胞分化程度分為高分化腺癌6例，中分化22例，低（未）分化65例。

2.2免疫組化結(jié)果 p16蛋白著色于癌細(xì)胞核及胞漿，CD44v6 著色于癌細(xì)胞膜。不同組織類型和分化程度的胃癌其分布方式無明顯差異。93例胃癌中，p16蛋白陽性37例（39.78%），CD44v6陽性39例（41.94%）。與對照組比較，均有顯著性差異（P<0.05，P<0.05）。見表1。在胃癌的陽性表達(dá)與患者性別、年齡、組織分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的關(guān)系見表2。p16蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的表達(dá)率30.8%，顯著低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組的表達(dá)率60.7%（P<0.01）。CD44v6在進(jìn)展期胃癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的陽性表達(dá)率43.8%、52.3%，顯著高于早期胃癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組的陽性表達(dá)率9.1%、17.9%（P<0.05，P<0.01）。

2.3 CD44v6與p16的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 p16、CD44v6的表達(dá)均與患者的預(yù)后有關(guān)，P16陽性表達(dá)者生存期≥3年及5年者分別為30.8% 、18.92%，而陰性者分別為25% 、10.71% 。CD44v6陽性表達(dá)者≥3年及5年的生存率分別為20.51%、10.26% ，而陰性者則分別是44.44% 、22.22%，見表3。但用Cox比例風(fēng)險模型分析，只有P16是獨(dú)立的預(yù)后因子，見表4。

2.4 CD44v6與P16表達(dá)的關(guān)系 在CD44v6呈陽性表達(dá)的37例胃癌中，P16呈陽性表達(dá)的有9例，CD44v6呈陰性表達(dá)的54例中P16呈陽性表達(dá)的有28例，經(jīng)統(tǒng)計分析，二者在胃癌組織中表達(dá)的關(guān)系（r =-0.476，P= 0.007），說明在胃癌組織中，CD44v6的表達(dá)隨著P16表達(dá)的減弱而增強(qiáng)，二者之間存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系，見表5。

3 討論

細(xì)胞之間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間黏附特性的異常，是腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的一個重要生物學(xué)特征。這種黏附特性的異常賦予腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落并向鄰近正常組織浸潤的能力，而腫瘤侵襲能力的大小是腫瘤惡性程度高低的標(biāo)志之一。CD44基因于1980年由Dalchau等采用單克隆技術(shù)檢測并確定的。CD44分子是細(xì)胞表面的黏附分子之一，根據(jù)基因外顯子表達(dá)方式的不同編碼生物學(xué)特性不同的兩種蛋白：標(biāo)準(zhǔn)型（CD44s）和變異型（CD44v）。CD44s的生理功能主要是參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與間質(zhì)之間的粘連；介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的歸巢及細(xì)胞的遷移。CD44v則主要出現(xiàn)在機(jī)體的病理過程，特別是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中[1]。CD44v的出現(xiàn)改變了腫瘤細(xì)胞表面黏附分子的構(gòu)成和功能，使腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。CD44v6是CD44的一種拼接異構(gòu)體，其表達(dá)可改變腫瘤細(xì)胞表面黏附分子的構(gòu)成和功能，有助于腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移潛能。CD44v6的促進(jìn)轉(zhuǎn)移作用機(jī)制可能是表達(dá)CD44v6的腫瘤細(xì)胞與遠(yuǎn)隔的淋巴管和血管內(nèi)某一配體結(jié)合，使轉(zhuǎn)移至那里的腫瘤細(xì)胞更加穩(wěn)定地寄宿與生長，有效形成轉(zhuǎn)移瘤。近年來通過免疫組化和原位雜交技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，CD44v6的過量表達(dá)與多種人體惡性腫瘤，如乳腺癌、胃癌、食管癌、宮頸癌等許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān) ，認(rèn)為CD44v6可作為獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)[1，2]。較多研究資料顯示：CD44v6陽性表達(dá)的腫瘤較陰性表達(dá)者惡性程度高，發(fā)展快，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，術(shù)后易復(fù)發(fā)，生存期短，預(yù)后差。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CD44v6在胃癌中的陽性表達(dá)率為54% ；在胃癌侵及黏膜及黏膜下層時，即胃癌的早期，就有CD44v6的陽性表達(dá)，且其陽性表達(dá)率隨胃癌的浸潤深度的加深而升高，這說明CD44v6的異常表達(dá)開始于胃癌的早期，且貫穿于胃癌的整個浸潤過程；其陽性表達(dá)率與淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示CD44v6的陽性表達(dá)參與了轉(zhuǎn)移過程。陽性者3年生存率明顯低于陰性者，提示該基因的異常表達(dá)有可能成為一個較好估計預(yù)后的指標(biāo)。對于CD44v6的陽性表達(dá)者，應(yīng)于術(shù)后嚴(yán)格進(jìn)行化療，預(yù)防胃癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。

P16基因是1994年分離鑒定的一種新型抑癌基因， 因其對多種腫瘤有抑制作用而被命名為多腫瘤抑制基因（MTSI）。P16基因定位于人染色體9p21區(qū)域，全長8.5 kb，由2個內(nèi)含子及3個外顯子構(gòu)成，分子量為15.85 KD，編碼表達(dá)一個148個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)（P16INK4）。p16基因產(chǎn)物作為細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)節(jié)成份，其功能的喪失會導(dǎo)致對 磷酸化抑制的解除，促使細(xì)胞增殖加快。研究發(fā)現(xiàn)[3-5]，P16基因及其產(chǎn)物在許多人類原發(fā)腫瘤和細(xì)胞株發(fā)生缺失，并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限制生長。本文顯示，CD44v6蛋白在胃癌組織中的陽性率顯著高于癌旁組織（P<0.05），而P16蛋白在胃癌組織中的陽性率顯著低于癌旁組織（P<0.05）。范開席等[6]研究顯示p16與胃癌組織學(xué)分化程度正相關(guān)，與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)，且p16陽性表達(dá)者的預(yù)后比陰性表達(dá)者好。他們的研究提示p16基因突變在胃癌中廣泛存在，并參與胃癌組織分化、浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)，其在胃癌的浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。陳廣斌等[7]也得出了類似的結(jié)論，他們的結(jié)果顯示伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中p16的表達(dá)水平明顯降低，且I、II期胃癌p16陽性表達(dá)率明顯高于III、Ⅳ 期，說明p16參與了胃癌的轉(zhuǎn)移與進(jìn)展。譚立新等[8]對p16與胃癌臨床分期的進(jìn)展也進(jìn)行了分析，他們研究表明P16的表達(dá)水平隨臨床分期的進(jìn)展、病情的加重而明顯降低，認(rèn)為P16的表達(dá)水平可作為判斷腫瘤惡性程度和估計預(yù)后重要指標(biāo)。楊蘇敏等[9]的研究則進(jìn)一步證實(shí)p16的蛋白的表達(dá)缺失不僅參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，并認(rèn)為p16可作為胃癌生物學(xué)標(biāo)志之一。楊雪炎等[10]在宮頸癌中也有類似發(fā)現(xiàn)。

本研究顯示CD44v6高表達(dá)和P16低表達(dá)與胃癌TNM分期、是否浸潤漿膜、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝臟轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P<0.05），表明CD44v6和P16在胃癌的發(fā)生、臨床進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。檢測CD44v6和P16蛋白表達(dá)均可作為預(yù)測胃癌侵襲轉(zhuǎn)移傾向及估計預(yù)后的客觀指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)，在胃癌中CD44v6表達(dá)與P16表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示p16和CD44v6在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中沿著各自的方向起不同的作用，同時存在某種負(fù)性調(diào)節(jié)作用。深入探討它們之間相互作用的機(jī)制，將對闡明腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制及阻斷其轉(zhuǎn)移途徑具有重要價值。

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